本文選題：微小RNA　切入點：JunD　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:椎間盤退行性改變的分子生物學(xué)機制仍不明確,髓核細(xì)胞凋亡增加在椎間盤退變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。TNF-a可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡,與椎間盤退變密切相關(guān),外源性因素作用于細(xì)胞表達受體,內(nèi)源性因素可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,其中就包括microRNAs(miRNAs)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)椎間盤退變患者的髓核組織中存在異常表達的miRNAs,其中microRNA-494(miR-494)異常高表達,然而,miR-494在TNF-a誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡中的潛在作用機制仍然不明確。使用TNF-a刺激髓核細(xì)胞,建立髓核細(xì)胞凋亡模型;運用慢病毒包裝miR-494轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,探究miR-494對TNF-a誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡的影響并探究其潛在作用機制,為椎間盤退變發(fā)病機制的研究奠定一定基礎(chǔ),開拓椎間盤退變基因診斷和生物治療新視野。方法:收集脊柱爆裂骨折患者病例資料及術(shù)中摘除的髓核組織,根據(jù)患者術(shù)前影像學(xué)資料(X線,CT,MRI)進行TLISS評分系統(tǒng)和載荷分享評分系統(tǒng)評分,根據(jù)MRI進行Pfirrmann分級評價椎間盤退變程度。運用酶消化法進行髓核細(xì)胞原代培養(yǎng),并鑒定獲取的髓核細(xì)胞。分別使用不同濃度TNF-a(0ng/ml,10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml)刺激髓核細(xì)胞,在0h,8h,16h,24h時間點,使用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-PE/7-AAD)和實時熒光定量PCR檢測髓核細(xì)胞凋亡率及mi R-494表達量。然后,將慢病毒包裝的antigomiR-494感染髓核細(xì)胞,成功敲除髓核細(xì)胞內(nèi)源性miR-494,轉(zhuǎn)染后再加入TNF-a(100ng/ml,16h),流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和熒光定量PCR檢測miR-494表達量。運用生物信息學(xué)方法、熒光素酶雙報告基因分析技術(shù)及免疫蛋白印跡技術(shù)(Western-blotting)驗證JunD是否是miR-494的靶基因之一。最后,Western-blotting檢測細(xì)胞色素C表達水平。結(jié)果:髓核細(xì)胞凋亡率隨TNF-a濃度和刺激時間的增加而增加(P0.05),miR-494表達量亦是隨TNF-a濃度和刺激時間的增加而增加(P0.05),然而100ng/ml,16h組,髓核細(xì)胞凋亡率最合適,用于后續(xù)實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,antigomiR-494+TNF-a組與對照病毒+TNF-a組相比,細(xì)胞凋亡率和miR-494表達量明顯下降(P0.05)。生物信息學(xué)方法預(yù)測、熒光素酶雙報告基因驗證證實miR-494直接靶向JunD基因。Western-blot結(jié)果顯示antigomiR-494+TNF-a組JunD蛋白表達水平較對照病毒+TNF-a組高,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),進一步說明miR-494對JunD基因的靶向作用,antigomiR-494+TNF-a組細(xì)胞色素C蛋白表達水平較對照病毒+TNF-a組低,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:本研究證實TNF-a可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡,且呈劑量和時間依賴性。髓核細(xì)胞miR-494表達量隨TNF-a刺激濃度、時間的增加而增加,miR-494可能是TNF-a誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,mi R-494敲除可以保護髓核細(xì)胞,其可能的機制是通過上調(diào)靶基因JunD并介導(dǎo)細(xì)胞色素C凋亡通路。miR-494-JunD-細(xì)胞色素C信號通路可能是椎間盤退變的潛在機制之一,其為未來椎間盤退變生物治療及預(yù)防提供了靶點。
[Abstract]:Objective: the molecular biology mechanism of intervertebral disc degeneration is still unclear, increased apoptosis of nucleus pulposus cells play an important role in the process of.TNF-a occurs in the development of intervertebral disc degeneration can induce the apoptosis of nucleus pulposus cells, closely associated with the degeneration of intervertebral disc, the effect of exogenous factors on the expression of receptor, endogenous factors may play a regulatory role, including including microRNAs (miRNAs). The abnormal expression of miRNAs previous study found that patients with intervertebral disc degeneration of the nucleus pulposus tissue, including microRNA-494 (miR-494), however, the abnormal high expression, miR-494 in TNF-a induced potential mechanism of nucleus pulposus cell apoptosis remains unclear. The use of TNF-a stimulation of nucleus pulposus cells, the establishment of the nucleus cell apoptosis model; using lentiviral packaging miR-494 transfection of nucleus pulposus cells, explore the effect of miR-494 on TNF-a induced apoptosis of nucleus pulposus cells and explore its potential mechanism, Lay a foundation for study on the pathogenesis of intervertebral disc degeneration, intervertebral disc degeneration to develop gene diagnosis and biological treatment of new horizons. Methods: collect spinal burst fracture nucleus pulposus extirpation of the clinical data and postoperative patients, according to preoperative imaging data (X-ray, CT, MRI) TLISS score system and load sharing scores according to the MRI score system, Pfirrmann classification and assessment of the degree of intervertebral disc degeneration. By enzymatic digestion of nucleus pulposus cells were cultured, and identified the nucleus pulposus cells. Using different concentrations of TNF-a (0ng/ml, 10ng/ml, 50ng/ml, 100ng/ml) stimulation of nucleus pulposus cells in 0h, 8h, 16h, 24h time point. The use of flow cytometry (Annexin V-PE/7-AAD) expression and detection of nucleus pulposus cell apoptosis rate and MI R-494 real-time fluorescence quantitative PCR. Then, the lentiviral packaging antigomiR-494 infection of nucleus pulposus cells, knockdown of endogenous nucleus pulposus cells successfully MiR-494 after transfection, then add TNF-a (100ng/ml, 16h), flow cytometry to detect the apoptosis rate and fluorescence quantitative PCR detection of miR-494 expression. By using bioinformatics method, dual luciferase gene analysis technology and protein immune imprinting technology (Western-blotting) verify whether JunD is the target gene of miR-494. Finally, the level of Western-blotting was used to detect the expression of cytochrome C. Results: the apoptosis of nucleus pulposus cells increased with the concentration of TNF-a and the stimulation time increased (P0.05), the expression of miR-494 was increased with the concentration of TNF-a and the stimulation time increased (P0.05), whereas 100ng/ml, 16h group, apoptosis of nucleus pulposus cells was most suitable for subsequent experiments. After transfection, antigomiR-494+TNF-a virus +TNF-a group compared with the control group, the apoptosis rate and the expression of miR-494 was significantly decreased (P0.05). The prediction method of bioinformatics, dual luciferase gene Verification of miR-494 directly targeting.Western-blot JunD gene showed that the expression level of JunD protein in antigomiR-494+TNF-a group than in the control group +TNF-a virus is high, and there was statistical significance (P0.05), suggested that miR-494 of JunD gene targeting, the expression of cytochrome C protein in antigomiR-494+TNF-a group than in the control group +TNF-a virus is low, and there was statistical significance (P0.05). Conclusion: This study showed that TNF-a can induce the apoptosis of nucleus pulposus cells, and showed a dose and time dependent manner. The expression of miR-494 in nucleus pulposus cells with TNF-a concentration and time increased, miR-494 may be the key to the nucleus pulposus cell apoptosis induced by TNF-a regulator, MI R-494 knockout can protect the nucleus cells, its possible mechanism is by up regulating the expression of target gene JunD and cytochrome C mediated apoptosis pathway of cytochrome.MiR-494-JunD- C signaling pathway may be the potential of intervertebral disc degeneration One of the mechanisms is a target for future biotherapy and prevention of intervertebral disc degeneration.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53

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本文編號：1722014