本文關鍵詞： 巨噬細胞/小膠質細胞 巨噬細胞極性 BDNF 脊髓損傷 炎癥反應　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：大量研究證實脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)可以通過多種機制發(fā)揮其神經(jīng)保護作用,進而抑制神經(jīng)元的凋亡,促進軸突再生,調節(jié)突觸傳遞,增強神經(jīng)興奮性,促進前體細胞的增殖和髓鞘再生。盡管有研究顯示BDNF具有抗炎抗氧化作用,并且對免疫反應具有一定的調節(jié)作用,但SCI后BDNF對炎癥反應的影響尚不明確。本課題通過系列研究證實SCI后損傷局部過表達BDNF可以明顯改善炎癥微環(huán)境,抑制促炎因子(IL-1β,TNF-a)的表達并上調抑炎因子(IL-10,IL-13)的表達,同時可以促進損傷區(qū)巨噬細胞/小膠質細胞表型由M1向M2轉變。此外,BDNF對炎癥反應的調解在一定程度上增強了其神經(jīng)保護作用并顯著促進了運動功能的恢復。第一部分:SCI后損傷中心處注射Lenti-BDNF載體成功過表達并以轉染損傷局部炎癥細胞為主材料與方法1.Lenti-BDNF載體構建;BDNF基因片段經(jīng)PCR擴增,將擴增的BDNF基因片段交換入線性化GV208表達載體,獲得GV208-BDNF慢病毒過表達質粒并轉化感受態(tài)細胞。陽性克隆菌落行PCR鑒定,對重組質粒進行測序后將其與慢病毒包裝系統(tǒng)共同轉染293T細胞進行病毒包裝,最后通過Real-time PCR法進行病毒滴度檢測。2.C57BL/6脊髓損傷模型建立;通過建立兩種常用SCI動物模型,T10節(jié)段背側半切模型和T10節(jié)段動脈夾夾傷模型。選擇適合于本課題慢病毒載體注射的SCI模型。3.損傷中心處Lenti-EGFP和Lenti-BDNF注射以及轉染細胞種類的鑒定;通過立體定向儀以及漢密爾頓微量進樣器向損傷中心處注射慢病毒載體,通過對損傷節(jié)段進行CD11b和GFAP免疫熒光染色,明確慢病毒轉染細胞種類。4.各組損傷節(jié)段BDNF表達水平檢測;慢病毒載體注射后第4天,通過ELISA檢測各組損傷節(jié)段(自損傷中心處向頭側和尾側各1.5mm)BDNF的表達水平。結果1.GV208-BDNF過表達質粒的陽性克隆鑒定顯示測序結果與目標序列比對完全一致。慢病毒包裝后Real time PCR法測定病毒滴度為2.00E+8TU/ml。2.T10節(jié)段背側半切模型和動脈夾夾傷模型都可以破壞小鼠的皮質脊髓束(CST)并造成后肢運動功能的喪失,但夾傷模型能夠更好的保護硬脊膜,減少病毒流失,更適合本課題研究。3.慢病毒注射后4天(脊髓損傷后第7天),共聚焦結果顯示EGFP細胞廣泛分布在損傷中心處,并且在轉染EGFP的細胞中,CD11b陽性細胞的百分比分在lenti-EGFP和Lenti-BDNF組中均達到了80%以上,說明在損傷中心灶注射的慢病毒載體主要轉染的細胞為損傷局部的炎癥細胞。4.通過ELISA對損傷節(jié)段處BDNF的總體表達水平檢測顯示lenti-BDNF組(62.63±8.74 ng/g)的表達水平明顯高于lenti-EGFP組(0.59±0.15 ng/g)以及saline組(0.68±0.13 ng/g)(P0.001)。結論1.Lenti-BDNF慢病毒包裝成功,病毒滴度較高,能夠滿足實驗需要。2.改良動脈夾夾傷模型能夠更好的保護硬脊膜完整,更適合損傷局部慢病毒注射。3.損傷中心處注射的慢病毒載體主要轉染的細胞為損傷局部的炎癥細胞。此種注射方法有利于對BDNF在免疫炎癥調節(jié)中的作用進行研究。4.通過ELISA定量檢測證實,Lenti-BDNF載體在損傷節(jié)段成功過表達。第二部分SCI后損傷處過表達BDNF在免疫炎癥調節(jié)和神經(jīng)保護中具有顯著作用第一節(jié):損傷中心處過表達BDNF可以促進巨噬細胞表型由M1向M2轉變并對炎癥微環(huán)境具有明顯的調節(jié)作用材料與方法1.實驗對象;成年雌性C57BL/6小鼠跟據(jù)注射載體的不同分為:Lenti-EGFP組,Lenti-BDNF組和Saline組(于損傷中心處注射生理鹽水)以及Sham組(僅進行椎板切除,不對脊髓造成損傷)。2.通過免疫熒光對巨噬細胞表型進行檢測;對各組損傷組織切片進行CD16/32(M1標記物)和Arginase-1(M2標記物)免疫熒光標記,檢測各組巨噬細胞表型的變化。3.通過流式細胞學進行M1/M2表型檢測分析;對損傷節(jié)段進行取材(損傷中心至頭側和尾側各1.5mm),消化,洗滌,過濾后獲得單細胞懸液,然后予以M1表型(CD16/32,i NOS,)和M2表型(arginase-1,CD206)流式抗體孵育及檢測。4.炎癥因子的表達水平檢測;對各組損傷節(jié)段促炎因子(TNF-a,IL-1β)和抑炎因子(IL-10,IL-13)的表達水平進行ELISA檢測。5.在體外培養(yǎng)骨髓來源巨噬細胞(BMDM)過程中進行BDNF刺激,并通過q RT-PCR檢測炎癥因子的表達水平以及通過Western Blot檢測arginase-1和i NOS的蛋白表達水平,以明確BDNF是否可以直接作用于對巨噬并對其表型產(chǎn)生影響。結果1.共聚焦結果顯示脊髓損傷后lenti-BDNF組arginase-1陽性細胞數(shù)相比lenti-EGFP組和saline組明顯增多(P0.05),而lenti-BDNF組CD16/32陽性細胞數(shù)比lenti-EGFP組和saline組明顯減少(P0.05)。此外,與Lenti-EGFP組相比Lenti-BDNF組中未與EGFP共定位的Arginase-1+細胞百分比明顯升高,同時未與EGFP共定位的CD16/32+細胞百分比顯著降低(P0.05)。2.流式結果分析顯示,與lenti-EGFP組和saline組相比,lenti-BDNF組中與M1表型相關的CD16/32和i NOS陽性細胞百分比明顯下降,而與M2表型相關的arginase-1和CD206陽性細胞百分比顯著上升。3.ELISA檢測結果顯示損傷局部過表達BDNF可以明顯降低促炎因子IL-1β和TNF-α的表達,同時顯著上調抑炎因子IL-10和IL-13的表達。4.在體外試驗中,q RT-PCR檢測經(jīng)BDNF刺激的BMDM的炎癥因子的表達與對照組無明顯差異,Western Blot檢測表型相關蛋白arginase-1和i NOS的表達與對照組亦無顯著差異。結論1.SCI后損傷中心處過表達BDNF可以促進巨噬細胞由M1向M2表型轉變,并且初步分析顯示,損傷處巨噬細胞極性的轉變可能并非通過BDNF直接作用于巨噬細胞引起的。2.過表達BDNF可以抑制促炎因子的表達并上調抑炎因子的表達水平,在改善炎癥微環(huán)境中具有一定的作用。3.體外重組BDNF刺激BMDM后,并未引起巨噬細胞表型的改變,表明重組BDNF不能直接作用于巨噬細胞。第二節(jié):損傷中心處過表達BDNF可以促進SCI后的神經(jīng)損傷修復材料和方法1.運動功能評估;通過曠場試驗對Lenti-EGFP和Lenti-BDNF兩組小鼠的行為學予以Basso Mouse Scale(BMS)評分,以評價BDNF對SCI后運動功能恢復的影響。2.脫髓鞘檢測;通過對Lenti-EGFP和Lenti-BDNF組脊髓損傷節(jié)段矢狀位切片進行Luxol Fast Blue(LFB)染色,以評估BDNF對髓鞘的保護作用。3.BDA(Biotinylated dextran amine)示蹤;脊髓損傷后14天向小鼠運動皮層予以BDA注射,對損傷后的皮質脊髓束(CST)進行示蹤,觀察BDNF對CST軸突回縮的影響。4.對損傷局部神經(jīng)纖維的影響;通過對Lenti-EGFP和Lenti-BDNF損傷節(jié)段進行NF-200免疫熒光染色,觀察BDNF對損傷局部神經(jīng)纖維的影響。結果1.通過對兩組小鼠損傷后1,3,7,14,28天進行BMS評分顯示,亞急性期Lenti-BDNF組的小鼠運動功能恢復較Lenti-EGFP組明顯提高。2.LFB染色結果顯示Lenti-BDNF組脫髓鞘程度較Lenti-EGFP組明顯減輕。3.結果顯示Lenti-BDNF組CST軸突末端距離損傷邊緣較Lenti-EGFP組明顯縮短,表明過表達BDNF可以顯著減少CST的軸突回縮。4.NF-200免疫熒光染色結果顯示損傷中心處過表達BDNF可以明顯抑制神經(jīng)纖維的崩解,具有明顯的神經(jīng)保護作用。結論SCI后損傷局部過表達BDNF能顯著促進神經(jīng)損傷修復,具有明顯的神經(jīng)保護作用。但需要注意的是:損傷中心處注射慢病毒載體以轉染損傷局部炎癥細胞為主,而并非損傷周圍的神經(jīng)元、軸突、少突膠質細胞等。所以本研究中BDNF對免疫炎癥反應的調節(jié)作用在神經(jīng)保護中可能起了重要的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

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