本文關(guān)鍵詞：脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立和轉(zhuǎn)分化的研究

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【摘要】：目的:在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞受到損傷活化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞后,探討亞低溫和過表達(dá)Neuro D1對脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。方法:1體外培養(yǎng)原代新生SD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞:從新生1~3 d SD大鼠脊髓組織中提取并純化星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞純度,用于制備反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(Reactive Astrocytes,RAS)。2劃痕實驗制備RAS:利用10μl無菌加樣槍頭在培養(yǎng)板中沿“井”字樣劃痕,控制統(tǒng)一的力度和速度。劃痕損傷后,更換培養(yǎng)基,并利用免疫熒光檢測RAS純度。3亞低溫對劃痕損傷后RAS的影響:試驗細(xì)胞分為4組:對照組、劃痕組、亞低溫組和劃痕+亞低溫組。其中對照組細(xì)胞為未經(jīng)劃痕損傷并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),劃痕組細(xì)胞行劃痕實驗并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),亞低溫組細(xì)胞未經(jīng)劃痕損傷并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),劃痕+亞低溫組細(xì)胞行劃痕實驗并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞在相應(yīng)的時間點觀察細(xì)胞形態(tài),利用免疫熒光染色方法檢測Nestin陽性率,MTT比色法檢測細(xì)胞活性,PI染色方法檢測細(xì)胞凋亡程度。4牽張實驗制備RAS:牽張損傷實驗裝置由Bioflex細(xì)胞培養(yǎng)板、CICⅡ型細(xì)胞損傷儀、高純氮氣組成。調(diào)整計量閥門壓力為12 PSI(Pounds per square inch),打擊后峰值為3 PSI。牽張損傷后,更換培養(yǎng)基,并利用免疫熒光檢測RAS純度。5亞低溫對牽張損傷后RAS的影響:試驗細(xì)胞分為4組:對照組、牽張組、亞低溫組和牽張+亞低溫組。其中對照組細(xì)胞為未經(jīng)牽張損傷并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),牽張組細(xì)胞行牽張實驗并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),亞低溫組細(xì)胞未經(jīng)牽張損傷并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),牽張+亞低溫組細(xì)胞行牽張實驗并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞在相應(yīng)的時間點觀察細(xì)胞形態(tài),利用MTT比色法檢測細(xì)胞活性,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放量檢測細(xì)胞損傷程度。6過表達(dá)Neuro D1對劃痕后RAS的影響:試驗分為3組:空白組(NV組)、對照病毒組(GFP組)和Neuro D1病毒組(Neuro D1組)。各組細(xì)胞行劃痕實驗后,NV組細(xì)胞不接受病毒感染,攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染GFP組細(xì)胞,同時攜帶GFP和Neuro D1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Neuro D1組細(xì)胞,24 h后同時更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基。各組細(xì)胞在相應(yīng)時間點觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并在感染病毒后7 d和14 d分別利用免疫熒光染色方法檢測細(xì)胞DCX陽性率和檢測細(xì)胞Neu N陽性率。結(jié)果:1原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度檢測:利用GFAP免疫熒光檢測第3次傳代后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP陽性率達(dá)到95%以上。利用流式細(xì)胞儀檢測純度可達(dá)到93.94%。2劃痕損傷和牽張損傷后RAS純度檢測:利用Nestin/GFAP免疫熒光雙染檢測劃痕損傷和牽張損傷后RAS純度,RAS純度可以用Nestin陽性率表示,劃痕損傷和牽張損傷后RAS的Nestin陽性率都在80%以上。3光學(xué)顯微鏡觀察劃痕損傷后細(xì)胞形態(tài)改變:細(xì)胞受到劃痕損傷后,細(xì)胞胞體變得肥大,周圍的突起開始增多并逐漸延展,細(xì)胞的胞漿變得豐富。處于亞低溫環(huán)境的細(xì)胞,變化相比減慢,周圍突起增多不明顯,并且細(xì)胞逐漸深入劃痕處所需要的時間增加。4光學(xué)顯微鏡觀察牽張損傷后細(xì)胞形態(tài)改變:細(xì)胞受到牽張損傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞胞體腫大,細(xì)胞周圍突起及連接多處斷裂,并且細(xì)胞開始活化增生。處于亞低溫環(huán)境的細(xì)胞,細(xì)胞變化不明顯,斷裂處恢復(fù)所需時間減少。5劃痕損傷后檢測各組細(xì)胞Nestin陽性率來反應(yīng)損傷后的活化程度:與對照組和亞低溫組相比,劃痕組和劃痕+亞低溫組明顯升高,說明劃痕損傷引起星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與劃痕組相比,劃痕+亞低溫組又較低,說明亞低溫可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。6劃痕損傷后檢測各組細(xì)胞PI陽性率來反應(yīng)損傷后的凋亡程度:與劃痕組和劃痕+亞低溫組相比,對照組和亞低溫組PI陽性率降低,說明劃痕造成細(xì)胞凋亡,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與劃痕組相比,劃痕+亞低溫組PI陽性率降低,表明亞低溫可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。7劃痕損傷后檢測各組細(xì)胞MTT值來反應(yīng)損傷后的生長率:與劃痕組和劃痕+亞低溫組相比,對照組和亞低溫組生長率在第3 d后明顯下降,說明劃痕引起細(xì)胞增生。與劃痕組相比,劃痕+亞低溫組各時間點生長率明顯降低,表明亞低溫可以抑制細(xì)胞活化增生。且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。8牽張損傷后檢測各組細(xì)胞MTT值來反應(yīng)損傷后的生長率:在損傷后的3 d或5 d,損傷組與對照組相比、損傷+亞低溫組與亞低溫組相比較,都是前者大于后者,表明牽張損傷后會導(dǎo)致RAS的增生。損傷組與損傷+亞低溫組相比較,在損傷后3 d,前者增長速率大于后者,表明亞低溫可以抑制RAS的增生。且都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。9牽張損傷后檢測各組細(xì)胞LDH值來反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度:在損傷后1 d,損傷組與對照組相比、損傷+亞低溫組與亞低溫組相比較,表明牽張損傷后會RAS受到損傷,并且在損傷后的2 d,損傷組的LDH釋放率大于1 d時的值,表明損傷組RAS進(jìn)一步損傷。損傷組與損傷+亞低溫組相比較,在損傷后2 d,前者LDH釋放率大于后者,表明亞低溫可以抑制RAS的損傷程度。且都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。10光學(xué)顯微鏡觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后形態(tài)改變:在病毒感染后的7 d內(nèi),各組細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變,胞核飽滿明顯,胞漿變得減少,周圍突起逐漸減少并延長。與Neuro D1組細(xì)胞相比,NV組和GFP組周圍突起短而分枝多,胞核變化不明顯。感染7 d后,NV組和GFP組細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)到以前形態(tài),而Neuro D1組細(xì)胞維持當(dāng)前形態(tài)。11逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞7 d后DCX陽性率:與NV組和GFP組的陽性率相比,Neuro D1組細(xì)胞的DCX陽性率增加明顯,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。12逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞14 d后Neu N陽性率:與NV組和GFP組的陽性率相比,Neuro D1組細(xì)胞的Neu N陽性率增加明顯,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1劃痕損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為RAS并會增生,亞低溫明顯抑制脊髓RAS的活化增生,并可以抑制RAS的凋亡。2牽張損傷后RAS突起及細(xì)胞連接處會發(fā)生斷裂,損傷后細(xì)胞增生明顯。亞低溫可明顯抑制RAS的活化增生,同時可以抑制細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。3細(xì)胞在體外培養(yǎng)中,Neuro D1的過表達(dá)可以介導(dǎo)脊髓RAS轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙明亮;陳以勝;李曉紅;王景景;涂悅;孫洪濤;張賽;陳，

本文編號：1235977