本文關(guān)鍵詞：共培養(yǎng)技術(shù)用于體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 目的：探索人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）與人軟骨細(xì)胞（human Articular Chontrocytes，hACs）的體外分離及培養(yǎng)過程，并對(duì)其進(jìn)行鑒定；嘗試?yán)棉D(zhuǎn)化因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）誘導(dǎo)hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化。 方法：取5～8歲兒童四肢長(zhǎng)骨骨折需髓內(nèi)釘固定者，抽吸其鉆孔后流出的骨髓，通過分離、離心獲得細(xì)胞，采用低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)，采取流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；使用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，繪制hBMSCs生長(zhǎng)曲線。利用TGF-β1誘導(dǎo)hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化。對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行阿利新藍(lán)染色、蕃紅花-亮綠染色檢測(cè)細(xì)胞蛋白聚糖Aggrecan，GAG），免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)II型膠原。取多指（趾）患兒切除下來的關(guān)節(jié)軟骨，分離、消化獲得軟骨細(xì)胞，，鑒定同hBMSCs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。 結(jié)果：hBMSCs呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，約2ml骨髓中獲得的hBMSCs經(jīng)10天左右可長(zhǎng)滿六孔板的一孔。傳代后，其第一代～第五代生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)至二十代漸出現(xiàn)凋亡。第三代hBMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD45表達(dá)陰性，CD29表達(dá)陽(yáng)性。利用TGF-β1誘導(dǎo)后的hBMSCs其阿利新藍(lán)、蕃紅花-亮綠及免疫組化II型膠原染色表達(dá)陽(yáng)性。 多指（趾）軟骨細(xì)胞2周長(zhǎng)滿六孔板的一孔。鑒定結(jié)果同hBMSCs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。 結(jié)論：1、在體外成功分離、培養(yǎng)了hBMSCs和hACs。 2、hBMSCs可來源于5～8歲兒童四肢長(zhǎng)骨骨髓。 3、成功利用轉(zhuǎn)化因子β1誘導(dǎo)hBMSCs分化成軟骨細(xì)胞。 二、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞共混培養(yǎng)體外構(gòu)建組織工程軟骨 目的：研究hACs與hBMSCs直接接觸共培養(yǎng)的最佳比例；比較混合培養(yǎng)與TGF-β1誘導(dǎo)hBMSCs體外構(gòu)建組織工程軟骨的效果。 方法：取上述分離培養(yǎng)后第三代hBMSCs和第三代hACs以2：1、1：1、1：2的比例共培養(yǎng)并接種于絲素蛋白支架（實(shí)驗(yàn)組A、B、C）。同時(shí)建立誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第三代hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化并接種于絲素支架的對(duì)照組D；建立單純第三代hACs接種于絲素支架的對(duì)照組E。保持各組細(xì)胞總數(shù)一致。將細(xì)胞-支架復(fù)合物進(jìn)行體外培養(yǎng)3周，采用倒置顯微鏡、大體形態(tài)、組織學(xué)HE染色、II型膠原染色、阿利新藍(lán)比色法測(cè)GAG含量及Hoechst33258熒光法行DNA定量分析進(jìn)行觀察。 結(jié)果：各組細(xì)胞在絲素蛋白三維支架上均生長(zhǎng)良好；各組細(xì)胞支架復(fù)合物外觀大小無明顯差異。A組（hBMSCs：hACs=2：1）與D組（TGF-β1誘導(dǎo)組）形成的細(xì)胞支架復(fù)合物彈性、光澤較差，組織學(xué)染色見細(xì)胞增殖少，細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平較低，GAG與DNA定量分析結(jié)果低于其他三組。C組（hBMSCs：hACs=1：2）構(gòu)建的細(xì)胞支架復(fù)合物具有最佳的彈性與光澤，組織學(xué)染色見細(xì)胞支架結(jié)合緊密，細(xì)胞增殖較多，胞外基質(zhì)豐富，GAG與DNA定量分析結(jié)果最高。B組（hBMSCs：hACs=1：1）與E組（單純hACs組）體外構(gòu)建的組織工程軟骨質(zhì)量相當(dāng)。 結(jié)論：1、hBMSCs與hACs之間的相互作用有利于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，比例為2：1時(shí)即可獲得與TGF-β1誘導(dǎo)hBMSCs相當(dāng)?shù)某绍浌切?yīng)。 2、hBMSCs與hACs直接接觸共培養(yǎng)比例為1：2時(shí)具有最佳的成軟骨效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨細(xì)胞 誘導(dǎo) 組織工程軟骨 共培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 材料和儀器準(zhǔn)備12-14
• 第一部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)14-22
• 一、實(shí)驗(yàn)方法14-16
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-17
• 三、討論17-21
• 四、結(jié)論21-22
• 第二部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞共混培養(yǎng)體外構(gòu)建組織工程軟骨22-34
• 一、實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 三、討論28-32
• 四、結(jié)論32-34
• 附圖34-41
• 參考文獻(xiàn)41-48
• 綜述48-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文61-62
• 中英文縮寫詞表62-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 黃粵;戴麗冰;鐘曉e

本文編號(hào)：427985