本文關(guān)鍵詞：組織工程纖維環(huán)-髓核復(fù)合組織的構(gòu)建及評估，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.評估絲素蛋白來源的一體化纖維環(huán)-髓核(AF-NP)支架作為組織工程椎間盤支架的可行性。2.探討取向性聚己內(nèi)酯(PCL)纖維環(huán)支架復(fù)合兔AF細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的可行性。3.探討以取向PCL/海藻酸鈉水凝膠復(fù)合兔椎間盤AF細(xì)胞和NP細(xì)胞裸鼠皮下構(gòu)建組織工程椎間盤的可行性。方法:1.以絲素蛋白溶液為原料,分別采用石蠟球致孔法和相分離法制備三維多孔一體化AF-NP支架。采用體視顯微鏡、掃描電鏡(SEM)觀察支架內(nèi)部結(jié)構(gòu),測定雙相支架AF相和NP相的孔徑、孔隙率及一體化支架壓縮彈性模量;分離培養(yǎng)兔AF細(xì)胞和NP細(xì)胞,接種至雙相支架的相應(yīng)部位,體外培養(yǎng)48 h,SEM、Live/dead、HE染色評價支架與細(xì)胞的生物相容性;CCK-8檢測細(xì)胞的增殖活性。2.以PCL為材料,采用濕紡-成形法制備環(huán)形取向微米纖維環(huán)支架。采用體式顯微鏡、SEM、Micro-CT觀察支架表面形態(tài)、纖維直徑,測定支架的孔隙率。分離培養(yǎng)兔AF細(xì)胞并接種至PCL支架上,體外培養(yǎng)。通過SEM、Live/dead、鬼筆環(huán)肽染色、Di I熒光標(biāo)記,觀察細(xì)胞在支架上的活性、形態(tài)、黏附、遷移情況,評價支架生物相容性。分別于體外培養(yǎng)1周、3周組織學(xué)染色觀察,并行MTT檢測及蛋白多糖、膠原生化定量分析;RT-PCR檢測AF細(xì)胞蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達(dá);同時檢測其力學(xué)性能。3.以PKH26標(biāo)記的AF細(xì)胞接種到取向PCL纖維支架,復(fù)合海藻酸鈉水凝膠包裹PKH67標(biāo)記的NP細(xì)胞,體外培養(yǎng)1周后,植入裸鼠皮下構(gòu)建組織工程椎間盤;體內(nèi)培養(yǎng)8周后,動物活體熒光成像系統(tǒng)檢測椎間盤細(xì)胞體內(nèi)熒光分布情況;復(fù)合物植入4周、8周后,取材、冰凍切片,觀察細(xì)胞熒光情況,行組織學(xué)染色評估;同時分析其力學(xué)性能。結(jié)果:1.體視顯微鏡和SEM見支架AF相和NP相均呈相互連通的多孔結(jié)構(gòu),孔隙高度連通,交接區(qū)域結(jié)合緊密;AF相孔徑為(220.0±23.1)μm,NP相孔徑為(90.0±17.8)μm;孔隙率分別為91%和93%;一體化支架壓縮彈性模量為(150.7±6.8)k Pa。SEM和HE染色見細(xì)胞均勻地黏附在支架表面,細(xì)胞周圍有細(xì)胞外基質(zhì)分泌;Live/dead染色顯示細(xì)胞活性良好;CCK-8增殖分析顯示兩種細(xì)胞均具有良好的增殖活性。2.體式顯微鏡、SEM、Micro-CT示PCL纖維排列呈平行取向,纖維表面光滑、規(guī)則,直徑均勻。纖維直徑(16.13±2.77)μm,孔隙率(69.33±6.67)%。SEM見細(xì)胞長梭形粘附在支架上;Live/dead染色示細(xì)胞活性良好;鬼筆環(huán)肽染色示細(xì)胞肌絲沿PCL纖維取向性伸展;Di I熒光標(biāo)記示細(xì)胞遷移滲透到支架內(nèi)部;組織學(xué)染色顯示細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均沿微米纖維取向性分布,且21天染色陽性強(qiáng)度較7天增強(qiáng);MTT分析,蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型膠原生化定量檢測顯示細(xì)胞增殖明顯,細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增加(P0.05);RT-PCR顯示細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達(dá)逐漸增加(P0.05)。壓縮模量和拉伸模量均隨培養(yǎng)時間增加而逐漸增加。3.組織工程化椎間盤大體觀察見圓盤狀類椎間盤樣組織;活體熒光成像系統(tǒng)顯示在AF相強(qiáng)紅色熒光,NP相上弱綠色熒光,其他位置未見明顯熒光;植入4周、8周后取材切片,熒光顯微鏡下觀察見AF細(xì)胞呈紅色熒光標(biāo)記的長梭形取向性生長,NP細(xì)胞呈綠色熒光標(biāo)記的圓形或短梭形生長,交界區(qū)域未見兩種細(xì)胞的明顯遷移混合;HE染色可見支架內(nèi)部有大量圓形或短梭形細(xì)胞;蕃紅-O染色示AF相與NP相均呈陽性,NP相陽性強(qiáng)度強(qiáng)于AF相;AF相Ⅰ型膠原免疫組化染色、NP相Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性,且8周組染色陽性強(qiáng)度增強(qiáng)。力學(xué)性能分析顯示細(xì)胞支架復(fù)合物壓縮模量隨植入時間增加而逐漸增加。結(jié)論:1.以天然絲素蛋白構(gòu)建一體化AF-NP支架,具有良好的孔徑、孔隙率和細(xì)胞相容性,具有優(yōu)越的力學(xué)性能,適合作為組織工程椎間盤支架。2.濕紡-成形法制備環(huán)形取向性PCL微米纖維支架復(fù)合兔AF細(xì)胞能夠構(gòu)建在解剖結(jié)構(gòu)、生化組成及力學(xué)性能上與天然纖維環(huán)組織相似的組織。3.以取向PCL纖維/海藻酸鈉水凝膠復(fù)合兔椎間盤AF細(xì)胞和NP細(xì)胞在裸鼠皮下能夠構(gòu)建在微觀結(jié)構(gòu)、生化組成、力學(xué)性能上與天然椎間盤相似的組織工程化椎間盤。
【關(guān)鍵詞】：椎間盤 組織工程 支架 絲素蛋白 聚己內(nèi)酯(PCL) 海藻酸鈉
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R681.53
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、絲素蛋白來源的一體化纖維環(huán)-髓核支架的制備與評估15-25
• 1.1 對象和方法15-19
• 1.1.1 實驗材料及試劑15
• 1.1.2 實驗試劑配制15-16
• 1.1.3 實驗儀器16
• 1.1.4 實驗方法16-19
• 1.2 結(jié)果19-23
• 1.2.1 絲素蛋白一體化AF-NP支架的評估19-20
• 1.2.2 一體化AF-NP支架的細(xì)胞相容性評估20-23
• 1.3 討論23-24
• 1.3.1 組織工程椎間盤的特點23
• 1.3.2 支架材料研究進(jìn)展和選擇23
• 1.3.3 一體化支架的理化特性23-24
• 1.3.4 一體化支架的細(xì)胞相容性24
• 1.4 小結(jié)24-25
• 二、取向性聚己內(nèi)酯纖維環(huán)支架復(fù)合兔纖維環(huán)細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程纖維環(huán)25-43
• 2.1 對象和方法25-34
• 2.1.1 實驗材料及試劑25
• 2.1.2 實驗試劑配制25-26
• 2.1.3 實驗儀器26
• 2.1.4 實驗方法26-34
• 2.2 結(jié)果34-40
• 2.2.1 環(huán)形取向PCL微米纖維環(huán)支架微觀結(jié)構(gòu)和理化性能評估34
• 2.2.2 組織工程纖維環(huán)中纖維環(huán)細(xì)胞行為評價34-35
• 2.2.3 組織學(xué)染色分析35
• 2.2.4 蛋白多糖、I型膠原、II型膠原定量分析35
• 2.2.5 纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的相關(guān)基因表達(dá)分析35
• 2.2.6 力學(xué)性能分析35-40
• 2.3 討論40-42
• 2.3.1 取向PCL微米纖維支架的制備40
• 2.3.2 PCL微米纖維支架細(xì)胞行為的影響40-41
• 2.3.3 組織工程纖維環(huán)的形成41
• 2.3.4 力學(xué)性能分析41-42
• 2.4 小結(jié)42-43
• 三、裸鼠皮下構(gòu)建仿生化組織工程椎間盤43-52
• 3.1 對象和方法43-45
• 3.1.1 實驗材料及試劑43
• 3.1.2 實驗試劑配制43
• 3.1.3 實驗儀器43
• 3.1.4 實驗方法43-45
• 3.2 結(jié)果45-50
• 3.2.1 大體觀察45
• 3.2.2 活體熒光成像分析45
• 3.2.3 組織工程化椎間盤熒光檢測45-46
• 3.2.4 組織學(xué)分析46
• 3.2.5 力學(xué)性能分析46-50
• 3.3 討論50-51
• 3.3.1 仿生組織工程椎間盤的構(gòu)建50
• 3.3.2 熒光標(biāo)記與活體熒光成像50-51
• 3.3.3 裸鼠皮下異位構(gòu)建仿生組織工程化椎間盤的可行性51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-62
• 綜述 椎間盤退變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究進(jìn)展62-70
• 綜述參考文獻(xiàn)67-70
• 致謝70

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本文編號：407425