癌癥是危害人類生命健康的重大疾病之一,放療和化療均存在不可忽略的副作用,基于小干擾RNA （siRNA）的核酸類藥物為癌癥的治療帶來了新的可能。選取合適的靶基因,將針對該基因的siRNA導入腫瘤細胞中,下調(diào)其表達,可以安全有效地抑制腫瘤生長。另一方面,由于并不是所有看似“完美”的靶基因都能夠通過siRNA直接沉默,當直接干擾其表達存在障礙時,可以繞開目的基因,對其合成致死相關(guān)基因進行干擾,在不損傷正常細胞的前提下,達到治療效果。本論文發(fā)展基于納米膠束的micelleplex載藥系統(tǒng),輸運siRNA治療癌癥,探索siRNA藥物抗腫瘤治療方案。在前一部分,論文利用官能化的聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物（mPEG-b-PCL-b-PPEEA）形成的膠束納米顆粒,制備micelleplex,攜載針對酸性神經(jīng)酰胺酶的siAC,經(jīng)系統(tǒng)給藥后,將siAC輸送至荷瘤小鼠的腫瘤細胞中,顯著抑制了乳腺腫瘤的生長,為乳腺癌的治療提供了新方法。在論文的后一部分,在KRAS突變的非小細胞肺癌腫瘤模型中,繞開了難以直接靶向的KRAS基因,利用KRAS與CDK4基因之間的合成致死效應,使用攜載有針對... 

【文章來源】：中國科學技術(shù)大學安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 癌癥臨床治療現(xiàn)狀及其瓶頸
    1.2 RNA干擾類藥物在腫瘤治療中的應用及面臨的問題
    1.3 納米藥物載體攜載小干擾RNA用于腫瘤治療
        1.3.1 脂質(zhì)類納米載體
            1.3.1.1 脂質(zhì)體/脂質(zhì)復合物
            1.3.1.2 穩(wěn)定的核苷酸脂質(zhì)顆粒(stable nucleic acid lipid particle,SNALP)
        1.3.2 聚合物類納米載體
            1.3.2.1 基于環(huán)糊精的納米顆粒
            1.3.2.2 基于殼聚糖的納米顆粒
            1.3.2.3 基于PEI的納米顆粒
            1.3.2.4 基于PLGA的納米顆粒
            1.3.2.5 基于樹枝狀大分子的納米顆粒
        1.3.3 siRNA鍵合物
        1.3.4 siRNA輸送體系的選擇
    1.4 RNA干擾靶點選擇
    1.5 選題依據(jù)
    參考文獻
第二章 基于陽離子型三嵌段共聚物的Micelleplex輸送小干擾RNA用于癌癥治療
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 細胞株
        2.2.3 主要藥品及試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 膠束納米顆粒(MNPs)的制備
        2.3.2 動態(tài)光散射檢測膠束納米顆粒的粒徑分布及表面電位
        2.3.3 瓊脂糖凝膠阻滯實驗檢驗膠束納米顆粒結(jié)合siRNA的能力
        2.3.4 細胞的傳代培養(yǎng)
        2.3.5 負載cy3-siRNA的納米顆粒細胞內(nèi)在化能力的研究
        2.3.6 熒光素酶報告基因檢測膠束納米顆粒輸送siRNA沉默目的基因的能力
        2.3.7 PCR檢測micelleplex_(siAC)對BT474細胞中AC mRNA表達的影響
        2.3.8 Western Blot檢測micelleplex_(siAC)對BT474細胞中AC蛋白表達的影響
        2.3.9 檢測micelleplex_(siAc)誘導BT474細胞產(chǎn)生凋亡
        2.3.10 克隆形成實驗檢測micelleplex_(siAC)對BT474細胞增殖的影響
        2.3.11 Micelleplex_(siAC)對乳腺癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
        2.3.12 BT474原位腫瘤模型建立
        2.3.13 乳腺癌原位腫瘤的治療及腫瘤體積測量
        2.3.14 腫瘤組織中的AC表達水平的檢測
        2.3.15 TUNEL法檢測腫瘤組織中細胞凋亡的情況
        2.3.16 BrdU染色檢測腫瘤組織中細胞的增殖情況
        2.3.17 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測荷瘤裸鼠血清中的免疫因子表達水平
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 膠束納米顆粒能有效攜載siRNA
        2.4.2 膠束納米顆�？梢詳y載siRNA進入腫瘤細胞
        2.4.3 Micelleplex_(siAC)下調(diào)報告基因Luciferase的表達
        2.4.4 Micelleplex_(siAC)下調(diào)內(nèi)源性基因酸性神經(jīng)酰胺酶的表達
        2.4.5 Micelleplex_(siAC)介導乳腺癌細胞的凋亡
        2.4.6 Micelleplex_(siAC)有效抑制原位乳腺癌小鼠腫瘤的生長
        2.4.7 Micelleplex_(siAC)下調(diào)腫瘤內(nèi)源性基因AC的表達
        2.4.8 免疫組化觀察治療結(jié)束后腫瘤的增殖水平以及凋亡水平
        2.4.9 Micelleplex_(siAC)不引起天然免疫反應
    2.5 本章小結(jié)
    參考文獻
第三章 混合膠束納米粒制備的Micelleplex輸送siRNA用于非小細胞肺癌的合成致死治療
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 主要材料
        3.2.2 細胞株
        3.2.3 主要藥品及試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 膠束納米顆粒(MNP)的制備
        3.3.2 動態(tài)光散射檢測膠束納米顆粒的粒徑分布及表面電位
        3.3.3 瓊脂糖凝膠電泳實驗檢驗膠束納米顆粒與siRNA的結(jié)合能力
        3.3.4 細胞的傳代培養(yǎng)
        3.3.5 Realtime PCR檢測MNP_(siCDK4)對不同細胞系中CDK4 mRNA表達的影響
        3.3.6 Western Blot檢測MNP_(siCDK4)對各細胞中CDK4蛋白表達的影響
        3.3.7 克隆形成實驗檢測MNP_(siCDK4)對細胞增殖的影響
        3.3.8 MTT實驗檢測MNP_(siCDK4)對各細胞的殺傷效果
        3.3.9 細胞共培養(yǎng)實驗檢測MNP_(siCDK4)對KRAS突變細胞的選擇性殺傷作用
        3.3.10 A549、H226皮下腫瘤模型的建立
        3.3.11 非小細胞肺癌腫瘤的治療及腫瘤體積測量
        3.3.12 腫瘤組織中的CDK4表達水平的檢測
        3.3.13 Western blot檢測腫瘤組織中KRAS的表達情況
        3.3.14 Ki-67染色檢測腫瘤組織中細胞的增殖情況
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 混合膠束納米顆粒能夠有效攜載siRNA
        3.4.2 膠束納米顆粒輸送siRNA顯著下調(diào)細胞中CDK4基因的表達
        3.4.3 膠束納米顆粒輸送siCDK4特異性抑制KRAS突變細胞活力
        3.4.4 膠束納米顆粒輸送siCDK4特異性抑制KRAS突變細胞增殖
        3.4.5 MNP_(siCDK4)可特異性抑制KRAS突變非小細胞肺癌腫瘤的生長
        3.4.6 MNP_(siCDK4)下調(diào)腫瘤內(nèi)源性基因CDK4的表達
        3.4.7 免疫組化觀察治療結(jié)束后腫瘤的增殖水平以及凋亡水平
    3.5 本章小結(jié)
    參考文獻
附錄一 主要儀器設備
附錄二 常規(guī)試劑
附錄三 主要溶液配制
附錄四 常規(guī)實驗方法
致謝
在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文與取得的研究成果



本文編號：3499021