本文關(guān)鍵詞：攜帶定點(diǎn)固載標(biāo)簽的人PTH表達(dá)純化及其納米抗體的淘選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人體內(nèi)過多的甲狀旁腺激素(PTH)會(huì)造成繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(SHPT)從而引發(fā)多系統(tǒng)病變,加重腎衰患者病情。目前,臨床上降低PTH的方法有藥物、手術(shù)、血液凈化三種治療方式。前兩者副作用很大,間接加重腎臟的負(fù)擔(dān),而目前存在的血液凈化方法對(duì)PTH的去除能力差,費(fèi)用高,因此開發(fā)特異性的高親和性吸附材料十分必要。納米抗體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),是配基材料的最佳選擇。目前利用噬菌體展示庫(kù)篩選抗體的方法比較成熟,但是傳統(tǒng)方法中利用疏水作用固載抗原篩選抗體會(huì)使蛋白二維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,因此并不適用于親水性的小分子蛋白類抗原。本研究將定點(diǎn)固載技術(shù)引入抗體篩選過程,可以保持抗原的天然構(gòu)象。本論文嘗試了兩種用于定點(diǎn)固載的標(biāo)簽,經(jīng)過比較,采用后者成功篩選出了抗人PTH的納米抗體。研究?jī)?nèi)容如下： (1)帶醛基的PTH的制備。利用合成的方法獲得了甲酰甘氨酸生成酶(FGE)及帶醛基標(biāo)簽前體的PTH的基因,并構(gòu)建了一系列載體,嘗試了體外催化和體內(nèi)共表達(dá)催化兩種醛基生成的策略,最后利用不相容質(zhì)粒的共表達(dá)體系得到了帶有醛基標(biāo)簽的目的蛋白,但帶醛基的蛋白產(chǎn)量低,尚需深入研究。 (2)帶巰基的PTH的制備。利用PCR技術(shù)在PTH的碳末端外加一個(gè)半胱氨酸,構(gòu)建載體pET23a-PTH-C,在腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了可溶表達(dá),表達(dá)量在25%-30%之間,經(jīng)過粗分離和陽離子交換層析,得到了純度95%以上的終產(chǎn)品,利用Ellman試劑定性檢測(cè),證實(shí)了存在自由巰基。 (3)定點(diǎn)固載抗原法篩選納米抗體。依據(jù)研究結(jié)果,利用巰基標(biāo)簽固載抗原,從非免疫納米抗體庫(kù)中篩選納米抗體。比較了傳統(tǒng)包被抗原法和定點(diǎn)包被抗原法,分別得到3種和13種納米抗體序列,而且前面3種全部包含在后面13種中,說明定點(diǎn)固載更有利于特異性抗體的富集。同時(shí)比較了定點(diǎn)包被時(shí)pH為8.0和7.0的情況,分別得到了4種和13種納米抗體,前者有3種包含于后者中,因此最佳固載pH為7.0。通過兩組比較,最終獲得了14種不同的納米抗體,經(jīng)噬菌體ELISA檢測(cè),有11種具有良好的結(jié)合活性。
【關(guān)鍵詞】：甲狀旁腺激素 醛基標(biāo)簽 巰基標(biāo)簽 納米抗體的篩選 定點(diǎn)固載
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-28
• 1.1 甲狀旁腺激素的致病機(jī)理及其導(dǎo)致的病癥的治療12-15
• 1.1.1 甲狀旁腺激素概述12-13
• 1.1.2 慢性腎衰竭及甲狀旁腺激素的致病機(jī)理13-14
• 1.1.3 降低腎衰竭病人體內(nèi)過多甲狀旁腺激素的方法14-15
• 1.2 納米抗體技術(shù)15-21
• 1.2.1 納米抗體的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特征15-17
• 1.2.2 納米抗體的理化生性質(zhì)及其應(yīng)用17-19
• 1.2.3 噬菌體展示庫(kù)簡(jiǎn)介19-20
• 1.2.4 納米抗體的篩選20-21
• 1.3 蛋白修飾技術(shù)21-27
• 1.3.1 蛋白修飾的目的21
• 1.3.2 蛋白的修飾方法21-26
• 1.3.3 醛基標(biāo)簽26-27
• 1.3.4 巰基標(biāo)簽27
• 1.4 本論文的研究目的、內(nèi)容及意義27-28
• 2 帶醛基標(biāo)簽的甲狀旁腺激素的制備28-46
• 2.1 引言28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料28-30
• 2.2.1 材料及試劑28-29
• 2.2.2 主要儀器及耗材29-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 2.3.1 FGE及ald_(13)-PTH基因的合成30-31
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pET23a-ald_(13)-PTH的構(gòu)建、篩選及表達(dá)31-32
• 2.3.3 重組蛋白ald_(13)-PTH的可溶性考察32
• 2.3.4 重組蛋白ald_(13)-PTH表達(dá)條件優(yōu)化32-33
• 2.3.5 化學(xué)合成的FGE相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選及表達(dá)33
• 2.3.6 重組質(zhì)粒pET28a-ald_(13)-PTH的構(gòu)建、篩選及表達(dá)33
• 2.3.7 改變重組質(zhì)粒pET23a-ald_(13)-PTH的抗性33-34
• 2.3.8 共表達(dá)體系的建立34-35
• 2.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳35
• 2.3.10 瓊脂糖凝膠電泳35
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論35-45
• 2.4.1 重組質(zhì)粒pET23a-ald_(13)-PTH的構(gòu)建、篩選及表達(dá)35-37
• 2.4.2 重組蛋白ald_(13)-PTH的可溶性考察37
• 2.4.3 重組蛋白ald_(13)-PTH表達(dá)條件優(yōu)化37-41
• 2.4.4 化學(xué)合成的FGE相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選及表達(dá)41-42
• 2.4.5 不相容質(zhì)粒共表達(dá)體系的建立42-45
• 2.5 小結(jié)45-46
• 3 帶巰基標(biāo)簽的甲狀旁腺激素的制備46-55
• 3.1 引言46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 3.2.1 材料及試劑46-47
• 3.2.2 主要儀器及耗材47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 3.3.1 PTH-C基因的獲得及載體構(gòu)建47-48
• 3.3.2 PTH-C蛋白的表達(dá)48
• 3.3.3 蛋白的可溶性考察48
• 3.3.4 蛋白預(yù)處理——初步純化48-49
• 3.3.5 SP強(qiáng)陽離子交換層析——精分離49-50
• 3.3.6 測(cè)定目的蛋白的純度及濃度50-51
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論51-54
• 3.4.1 PTH-C蛋白的表達(dá)51
• 3.4.2 蛋白的可溶性考察51-52
• 3.4.3 蛋白的分離純化52-54
• 3.5 小結(jié)54-55
• 4 抗人PTH納米抗體的篩選55-75
• 4.1 引言55
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料55-57
• 4.2.1 材料及試劑55-56
• 4.2.2 主要儀器及耗材56-57
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法57-63
• 4.3.1 納米抗體庫(kù)的建立57
• 4.3.2 噬菌體的液體擴(kuò)增57
• 4.3.3 噬菌體滴度的測(cè)定57-58
• 4.3.4 納米抗體的篩選58-59
• 4.3.5 序列分析59-60
• 4.3.6 ELISA鑒定單克隆噬菌體活性60-61
• 4.3.7 親和常數(shù)的估算61-63
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論63-74
• 4.4.1 納米抗體的篩選63-64
• 4.4.2 測(cè)序分析64-69
• 4.4.3 ELISA鑒定單克隆噬菌體活性69-71
• 4.4.4 親和常數(shù)的估算71-74
• 4.5 小結(jié)74-75
• 結(jié)論75-76
• 展望76-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 附錄A FGE基因序列82-84
• 附錄B ald_(13)-PTH基因序列及蛋白序列84-85
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況85-86
• 致謝86-87

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：攜帶定點(diǎn)固載標(biāo)簽的人PTH表達(dá)純化及其納米抗體的淘選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：330966