本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建人工復(fù)合皮的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）與脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層組織(Small Intestinal Submucosa, SIS)在體外復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建人工復(fù)合皮膚，并應(yīng)用于兔全層皮膚缺損創(chuàng)面。全面觀察其修復(fù)創(chuàng)面的能力，從而驗(yàn)證其作為人工復(fù)合皮膚的可行性。 方法： （1）利用骨髓穿刺法抽取兔脛骨近端或股骨遠(yuǎn)端骨髓，再運(yùn)用密度梯度離心法及差速貼壁法分離純化BMSCs。用含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS)的DMEM/F-12培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱對(duì)其進(jìn)行孵育，體外培養(yǎng)擴(kuò)增至第三代。觀察各代細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況并對(duì)純化后的第三代細(xì)胞進(jìn)行體外鑒定。用含綠色熒光蛋白（Green FluorescentProtein, GFP）基因的慢病毒對(duì)第三代BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將其標(biāo)記，達(dá)到示蹤效果。 （2）利用酶-去垢劑法制備脫細(xì)胞SIS，并行HE染色及電鏡檢查檢測(cè)脫細(xì)胞是否徹底。以密度為106/cm2將GFP-BMSCs接種于已脫細(xì)胞處理的SIS上共培養(yǎng)10天以構(gòu)建人工復(fù)合皮膚，，熒光顯微鏡及電子顯微鏡下觀察GFP-BMSCs在SIS中的定植情況。 （3）在日本大耳兔背部脊柱兩側(cè)制備3個(gè)全層皮膚缺損模型并隨機(jī)分組，分為A、B、C三組。A、B組創(chuàng)面分別移植人工復(fù)合皮膚，單純脫細(xì)胞SIS，C組為空白創(chuàng)面。術(shù)后觀察全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合情況，并記錄各組創(chuàng)面完全愈合時(shí)間行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別于術(shù)后7、14、21、28天對(duì)各組創(chuàng)面大小進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面收縮率（創(chuàng)面收縮率=（原創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100％）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí)在上述各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行創(chuàng)面組織取材，觀察各組創(chuàng)面組織的情況如質(zhì)地、厚度并進(jìn)行比較分析，然后行HE染色組織學(xué)檢查，觀察各組創(chuàng)面在愈合過程中的組織學(xué)結(jié)構(gòu)的改變情況。 結(jié)果： （1）運(yùn)用密度梯度離心法及差速貼壁法分離純化BMSCs，倒置顯微鏡下觀察BMSCs呈梭形，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞克隆生長(zhǎng)融合后可呈“魚群樣”排列；傳代培養(yǎng)時(shí)5-6天即可達(dá)80%融合，且隨著傳代，BMSCs的形態(tài)趨為均一。分離純化后的BMSCs能向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化。熒光顯微鏡下見轉(zhuǎn)染標(biāo)記后的BMSCs生長(zhǎng)良好，熒光強(qiáng)。 （2）制備的脫細(xì)胞SIS，HE染色及掃描電鏡下觀察均未見細(xì)胞殘留。人工復(fù)合皮膚成功構(gòu)建：熒光顯微鏡下見GFP-BMSCs能粘附定植于SIS并在其表面伸展，生長(zhǎng)良好；共培養(yǎng)10天后掃描電鏡下見多量細(xì)胞粘附于SIS的膠原纖維上，多呈梭形。 （3）創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，A、B、C組創(chuàng)面完全愈合時(shí)間分別為20.83±1.17d，23.50±1.05d，27.67±1.03d，A組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯比其他兩組短，與其他兩組相比具有明顯差異（P0.01）。在術(shù)后7、14、21、28天創(chuàng)面收縮率的比較中，A組與其他兩組相比均更小，差異非常顯著（P0.01）。在術(shù)后7、14、21、28天創(chuàng)面組織厚度的比較上，A組與其他兩組相比均更軟，更�。ㄅcB組相比，P0.05，差異顯著；與C組相比較，P0.01，差異非常顯著）。即A組創(chuàng)面愈合時(shí)間短，創(chuàng)面收縮率小，創(chuàng)面組織較軟、薄。HE染色顯示，A組創(chuàng)面愈合前期上皮化速度快，中后期毛細(xì)血管及小血管增殖豐富，膠原纖維改建快，與其它兩組有明顯差異。 結(jié)論： （1）密度梯度法及差速貼壁法簡(jiǎn)單易行，可以較高純度地分離擴(kuò)增BMSCs，分離的BMSCs活力好，增殖能力強(qiáng)。 （2）酶-去垢劑法可以有效徹底地脫去SIS中的細(xì)胞。BMSCs與SIS在體外復(fù)合培養(yǎng)可構(gòu)建人工復(fù)合皮。 （3）利用BMSCs構(gòu)建的復(fù)合皮修復(fù)全層缺損創(chuàng)面時(shí)，能促進(jìn)小血管形成及創(chuàng)面上皮化，加速創(chuàng)面愈合；能降低創(chuàng)面收縮率，使創(chuàng)面組織更薄及柔軟，從而能改善愈合質(zhì)量。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 人工復(fù)合皮膚 全層皮膚缺損 創(chuàng)面修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-19
• 2.1 主要試劑、主要儀器及標(biāo)本來源13-14
• 2.2 BMSCs 的分離、擴(kuò)增，鑒定及轉(zhuǎn)染標(biāo)記14-16
• 2.2.1 BMSCs 的分離、擴(kuò)增14-15
• 2.2.2 BMSCs 的鑒定15-16
• 2.2.3 BMSCs 的標(biāo)記16
• 2.3 脫細(xì)胞 SIS 的制備及人工復(fù)合皮膚的構(gòu)建16-17
• 2.3.1 脫細(xì)胞 SIS 的制備16-17
• 2.3.2 人工復(fù)合皮的體外構(gòu)建17
• 2.4 人工復(fù)合皮膚的創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)17-19
• 2.4.1 動(dòng)物創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)17-18
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)18
• 2.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理18-19
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-25
• 3.1 BMSCs 的分離、擴(kuò)增，鑒定及轉(zhuǎn)染標(biāo)記19-20
• 3.1.1 BMSCs 的分離，擴(kuò)增19
• 3.1.2 BMSCs 的鑒定19-20
• 3.1.3 BMSCs 的轉(zhuǎn)染標(biāo)記20
• 3.2 脫細(xì)胞 SIS 的制備及人工復(fù)合皮膚的構(gòu)建20-21
• 3.2.1 脫細(xì)胞 SIS 的制備20
• 3.2.2 人工復(fù)合皮的體外構(gòu)建20-21
• 3.3 人工復(fù)合皮膚的創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)21-25
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)大體觀察21-22
• 3.3.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面面積22
• 3.3.3 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面收縮率的比較分析22-23
• 3.3.4 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面組織質(zhì)地及厚度的比較分析23
• 3.3.5 各組創(chuàng)面完全愈合時(shí)間及比較分析23-24
• 3.3.6 HE 染色組織學(xué)觀察24-25
• 第4章 討論25-31
• 4.1 種子細(xì)胞的選擇25-26
• 4.2 真皮支架的選擇26-27
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論27-31
• 第5章 結(jié)論及展望31-32
• 致謝32-33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 附圖35-41
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果41-42
• 綜述42-51
• 參考文獻(xiàn)47-51

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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9 方利君;付小兵;程飚;孫同柱;李建福;曹榮;王玉新;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與皮脂腺導(dǎo)管構(gòu)成的初步研究[J];感染.炎癥.修復(fù);2003年04期

10 方利君,付小兵,孫同柱,李建福,程飚,楊銀輝,王玉新,王通;在體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的初步觀察[J];中華創(chuàng)傷雜志;2003年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 艾國平;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)合并局部放射損傷創(chuàng)傷愈合作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2001年

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本文編號(hào)：322565