發(fā)布時間：2017-04-23 13:05

  本文關鍵詞：BMP2和EGFP重組腺病毒體外轉染兔骨髓間充質干細胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的1.本實驗為建立一套行之有效的體外培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）的方法。2.通過腺病毒介導人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)和EGFP基因轉染兔BMSCs后，通過行Westenblot及免疫細胞化學染色以觀察BMP2和EGFP的表達情況。方法1.用骨穿針抽取兔股骨粗隆處的骨髓，通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁法，分離、培養(yǎng)兔BMSCs并觀察細胞生長情況。2.使用成骨誘導培養(yǎng)基(含地塞米松10-8mol/L、維生素C50mg/L、β-磷酸甘油10mmol/L、體積分數(shù)為15%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液)，在誘導后第7天、14天分別檢測Ⅰ型膠原及堿性磷酸酶（ALP），成骨誘導后第3周行鈣結節(jié)檢測；流式細胞儀檢測細胞周期和表面標記。3.轉染后，通過免疫細胞化學染色及蛋白印跡檢測外源基因的表達。結果1.分離出大量具有活性的兔BMSCs。接種48小時后觀察，細胞貼壁形態(tài)均表現(xiàn)為長梭形，呈渦旋狀、放射狀排列。一般4～5d左右可長滿培養(yǎng)瓶底壁。2.兔BMSCs細胞周期約有56.84%處于G1期；CD44表達陽性，CD45表達陰性；經(jīng)成骨細胞誘導后，Ⅰ型膠原免疫組化染色顯示誘導組細胞胞質呈陽性表達表現(xiàn)為棕黃色，正常組胞質陰性表達。ALP酶標法顯示誘導組呈陽性表達，其含量較正常組明顯增加。實驗組誘導組茜素紅染色呈陽性，正常組未染色。3.轉染48h后，通過免疫組化檢測結果示兔BMSCs細胞胞漿可見棕黃色染色，呈陽性表達，而未轉染細胞呈陰性。分別提取轉染48h后及未轉染的細胞蛋白，Western-blot檢測到Ad-BMP2/EGFP組有陽性條帶，而Ad-EGFP組及未轉染組的條帶較弱。說明Ad-BMP-2/EGFP轉染兔BMSCs后BMP2目的蛋白在細胞內有高表達。結論1.通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可以獲得純化的兔骨髓間充質干細胞。2.通過將轉染目的基因的骨髓基質干細胞行免疫組化、Westenblot實驗證實轉染后細胞可高效表達BMP-2并促進其增殖分化。
【關鍵詞】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 腺病毒 骨髓間充質干細胞 基因轉染
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英漢縮略詞對照表8-10
• 前言10-13
• 1 材料和方法13-27
• 1.1 材料與儀器13-17
• 1.2 實驗方法17-27
• 2 結果27-36
• 2.1 兔 BMSCs 的形態(tài)觀察27
• 2.2 兔 BMSCs 生長曲線27-28
• 2.3 組織學染色28-29
• 2.4 兔骨髓間充質干細胞表面標志物的鑒定29
• 2.5 兔 BMSCs 向成骨細胞方向分化29-32
• 2.6 流式細胞儀測兔骨髓間充質細胞周期32-33
• 2.7 感染 Ad-BMP-2/EGFP 后兔 BMSCs 中綠色熒光蛋白的表達33-34
• 2.8 免疫組化檢測 BMP-2 的表達34-35
• 2.9 Westen blot 檢測分泌 BMP-2 蛋白表達35-36
• 3 討論36-39
• 結論39-40
• 參考文獻40-44
• 綜述44-56
• 參考文獻51-56
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄56-57
• 致謝57-58

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：BMP2和EGFP重組腺病毒體外轉染兔骨髓間充質干細胞的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：322422