本文關(guān)鍵詞：用精胺修飾家蠶絲素及其作為基因傳遞載體，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：促進(jìn)三維支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的生成是引導(dǎo)皮膚真皮組織再生的關(guān)鍵問題。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是兩種最重要的是僅以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞的促血管再生生長(zhǎng)因子,但生長(zhǎng)因子的半衰期短。尋找合適的載體將生長(zhǎng)因子的基因包被、壓縮后,載入真皮再生支架內(nèi),使外源性基因原位轉(zhuǎn)染細(xì)胞,細(xì)胞穩(wěn)定、高效地表達(dá)相應(yīng)的促血管生長(zhǎng)因子,刺激血管的再生,是加快真皮再生支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的生成速度、促進(jìn)真皮組織再生的途徑。家蠶絲素蛋白(BSF)具有良好的生物相容性,可被生物降解性,含有一定數(shù)量的極性氨基酸殘基可以作為化學(xué)反應(yīng)活性位點(diǎn),通過化學(xué)修飾使其表面帶負(fù)電荷翻轉(zhuǎn)成帶正電荷,可能作為促血管再生因子的基因載體,用于促進(jìn)真皮再生支架內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)再生。本文用精胺對(duì)絲素蛋白化學(xué)修飾,使絲素蛋白表面帶負(fù)電荷翻轉(zhuǎn)為正電荷,建立絲素蛋白的陽離子化技術(shù);然后用陽離子化絲素蛋白(CMBSF)和聚乙烯亞胺(PEI)聯(lián)合包被含VEGF和Ang-1編碼的質(zhì)�；�(p DNA)形成復(fù)合物,保護(hù)、壓縮p DNA并使其表面帶正電荷,建立VEGF165-Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的傳遞載體新技術(shù)。在體外,一方面轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞,研究包被p DNA的方式對(duì)基因轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞毒性的影響;另一方面,將復(fù)合物裝載在絲素支架內(nèi),通過雞胚絨毛尿囊膜血管形成實(shí)驗(yàn),研究包被p DNA的方式對(duì)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的效果,促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)生成的影響。在體內(nèi),將質(zhì)粒復(fù)合物裝載在多孔絲素支架內(nèi)后,植入SD大鼠背部真皮缺損創(chuàng)面,研究載體內(nèi)p DNA是否能夠原位轉(zhuǎn)染創(chuàng)面細(xì)胞,促進(jìn)絲素支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的形成、促進(jìn)創(chuàng)面真皮組織的再生。首先,精胺對(duì)家蠶絲素蛋白陽離子化改性,由碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)激活家蠶絲素蛋白側(cè)鏈上的-COOH,可以將帶正電荷的精胺上偶合于絲素蛋白的側(cè)鏈。經(jīng)精胺修飾的絲素蛋白表面的zeta電位由負(fù)值變?yōu)檎?其等電點(diǎn)由4.20變?yōu)?.04。其次,探究包被p DNA的方式對(duì)EA.hy926細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染的影響,通過激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)與PEI/p DNA復(fù)合物相比,(CMBSF+PEI)/p DNA和CMBSF/BSF/PEI/p DNA復(fù)合物對(duì)EA.hy926細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(24h)明顯較好,且細(xì)胞的形態(tài)變好,細(xì)胞核縮現(xiàn)象明顯減弱,CCK-8試劑測(cè)試細(xì)胞活力提高。此外研究(CMBSF+PEI)/p DNA和CMBSF/BSF/PEI/p DNA復(fù)合物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用,通過圖片觀察得出,與空白絲素支架組、PEI/p DNA組相比,裝載(CMBSF+PEI)/p DNA和CMBSF/BSF/PEI/p DNA復(fù)合物的多孔絲素蛋白支架上布滿了豐滿旺盛的血管,血管呈現(xiàn)放射葉脈狀,通過Image-Pro Plus軟件分析支架內(nèi)的血管新生面積率明顯增多。最后,裝載VEGF165-Ang-1p DNA復(fù)合物對(duì)真皮再生支架血管生成的影響,通過組織學(xué)觀察和Image-Pro Plus圖像分析軟件得出,在植入體內(nèi)1周時(shí),與空白支架組相比,含質(zhì)粒復(fù)合物的支絲素架上新生組織率、促血管生長(zhǎng)因子的陽性表達(dá)率沒有顯著性差異;而在植入體內(nèi)2周時(shí),與空白支架組相比,含質(zhì)粒復(fù)合物的支架上新生組織率、新生微血管密度和VEGF、Ang-1和PDGF生長(zhǎng)因子的陽性表達(dá)率均有顯著性差異;在植入體內(nèi)4周時(shí),含質(zhì)粒復(fù)合物的支架上新生組織率明顯提高,膠原纖維化,而新生微血管密度和VEGF、Ang-1和PDGF生長(zhǎng)因子的陽性表達(dá)率均明顯減少,絲素支架基本上降解,新生組織幾乎填充絲素支架的空隙結(jié)構(gòu)。說明含質(zhì)粒復(fù)合物的支架植入體內(nèi)有利于新生血管、新生組織的生長(zhǎng),加快真皮缺損部位的修復(fù)。本文首次用精胺對(duì)家蠶絲素蛋白化學(xué)修飾,使絲素蛋白陽離子化。系統(tǒng)地探究(CMBSF+PEI)/p DNA復(fù)合物和CMBSF/BSF/PEI/p DNA復(fù)合物分別對(duì)EA.hy926細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況和細(xì)胞毒性的影響,首次研究將這兩類含VEGF165-Ang-1雙基因復(fù)合物裝載在多孔絲素支架上對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的情況、促血管的生長(zhǎng)及真皮組織缺損修復(fù)的影響。研究得出(10μg CMBSF+5μg PEI)/2μg p DNA復(fù)合物和20μg CMBSF/150μg BSF/10μg PEI/2μg p DNA復(fù)合物為最佳參數(shù)質(zhì)量比,它們的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果很好,細(xì)胞毒性減低,在雞胚絨毛尿囊膜、植入SD大鼠背部實(shí)驗(yàn)中對(duì)新生血管、新生組織的生長(zhǎng)有顯著性影響。
【關(guān)鍵詞】：絲素蛋白 化學(xué)修飾 基因載體 多孔支架
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ936;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-23
• 1.1 組織工程中促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)生成的方法11-12
• 1.2 VEGF和Ang-1 生長(zhǎng)因子及其基因的促血管化作用12-14
• 1.3 基因傳遞載體14-17
• 1.4 家蠶絲素蛋白及其化學(xué)改性17-19
• 1.5 精胺19-20
• 1.6 本文的研究目的和內(nèi)容20-23
• 第二章 精胺對(duì)家蠶絲素蛋白的陽離子化改性23-31
• 2.1 材料與方法23-26
• 2.2 結(jié)果與討論26-30
• 2.2.1 精胺與家蠶絲素的反應(yīng)過程26-27
• 2.2.2 陽離子化的家蠶絲素蛋白的zeta電位27-28
• 2.2.3 陽離子化家蠶絲素蛋白的等電點(diǎn)28
• 2.2.4 陽離子化家蠶絲素蛋白的紅外光譜28-29
• 2.2.5 復(fù)合物中CMBSF和pDNA的結(jié)合29-30
• 2.3 本章小結(jié)30-31
• 第三章 （CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF/ BSF/ PEI /pDNA復(fù)合物的制備和表征31-41
• 3.1 材料與方法31-34
• 3.2 結(jié)果與討論34-40
• 3.2.1 （CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF / BSF/ PEI / pDNA復(fù)合物形成過程34-36
• 3.2.2 復(fù)合物中PEI、CMBSF、BSF和pDNA的結(jié)合36-37
• 3.2.3 （CMBSF+PEI）/pDNA復(fù)合物的粒徑和表面zeta電位37-38
• 3.2.4 CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物的粒徑和表面zeta電位38-39
• 3.2.5 （CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物的表面形態(tài)39-40
• 3.3 本章小結(jié)40-41
• 第四章 （CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF/ BSF/ PEI /pDNA復(fù)合物對(duì)EA.hy926 細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染41-54
• 4.1 材料與儀器41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 4.3 結(jié)果與討論45-53
• 4.3.1 復(fù)合物對(duì)EA.hy926 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 h的情況45-47
• 4.3.2 復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)EA.hy926 細(xì)胞活力的影響47-48
• 4.3.3 EA.hy926 細(xì)胞在多孔絲素支架內(nèi)生長(zhǎng)的SEM觀察48-50
• 4.3.4 在多孔絲素支架內(nèi)裝載復(fù)合物轉(zhuǎn)染EA.hy926 細(xì)胞的情況50-53
• 4.4 本章小結(jié)53-54
• 第五章 （CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF/ BSF/ PEI /pDNA復(fù)合物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用54-63
• 5.1 材料與儀器54
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法54-57
• 5.3 結(jié)果與討論57-62
• 5.3.1 （CMBSF+PEI）/pDNA復(fù)合物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成的影響57-58
• 5.3.2 CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成的影響58-62
• 5.4 本章小結(jié)62-63
• 第六章 （CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF/ BSF/ PEI /pDNA復(fù)合物對(duì)再生支架內(nèi)血管再生的影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)63-81
• 6.1 材料與儀器63-64
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法64-67
• 6.3 結(jié)果與討論67-80
• 6.3.1 大體觀察67-68
• 6.3.2 組織學(xué)觀察68-74
• 6.3.3 免疫組化分析74-80
• 6.4 本章小結(jié)80-81
• 第七章 結(jié)語81-84
• 7.1 全文結(jié)論81-82
• 7.2 本文的創(chuàng)新點(diǎn)82-83
• 7.3 本文的不足之處83
• 7.4 今后的進(jìn)一步研究計(jì)劃83-84
• 參考文獻(xiàn)84-93
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開的論文93-94
• 致謝94-95

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 陳彥祥;喬衛(wèi)紅;劉棟良;李宗石;;陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染機(jī)制及轉(zhuǎn)染效率影響因素[J];生物工程學(xué)報(bào);2007年05期

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3 楊碩曄;陳西敬;;陽離子脂質(zhì)體用做基因傳遞載體的研究進(jìn)展[J];中國(guó)新藥雜志;2010年20期

4 湯谷平;范輝;胡奇達(dá);;陽離子聚合物作為基因載體的研究進(jìn)展[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年06期

  本文關(guān)鍵詞：用精胺修飾家蠶絲素及其作為基因傳遞載體，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：321367