發(fā)布時間：2020-11-08 12:33

　　 微生物與人類的生活息息相關,例如食品、化學制品、藥物、生物能源、生物材料和酶的生產(chǎn)經(jīng)常會用到酵母、細菌和真菌等微生物。隨著系統(tǒng)生物學、合成生物學和醫(yī)學的發(fā)展,高通量篩選稀有微生物個體,高效固定微生物以及精確控制微生物產(chǎn)物自組裝的研究,已經(jīng)成為今天生物醫(yī)學工程研究的重要內(nèi)容之一。傳統(tǒng)的微生物操控方法主要基于瓊脂糖平板或多孔板。這些方法操作繁瑣、通量低,不利于微生物細胞的精確控制。微流控技術(shù)近年來發(fā)展十分迅速,得益于其便于制作、樣品消耗少、操作簡單、通量高等諸多的優(yōu)勢。由于微流控芯片是一個微納米級別的操作平臺,尺寸上與微生物存在著較好匹配,從而微流控芯片能夠作為一個很好的平臺用于微生物的各項研究。本文基于瓊脂糖凝膠和微流控常用材料聚二甲基硅氧烷(PDMS),探討了功能性微生物高通量篩選、微生物高效固定以及細菌纖維素自組裝的微流控新技術(shù)研究,主要研究如下:1、設計了一種基于瓊脂糖凝膠的微孔陣列芯片,用于微生物單細胞在微孔中的固定及生長,探討了在單克隆水平下功能性微生物的高通量篩選。利用綠色熒光蛋白(GFP)標記的大腸桿菌(E.coil)作為模式菌株來觀察細菌細胞在不同尺寸陣列芯片上的分布和生長;利用產(chǎn)脂肪酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus)作為模式菌株來探索細菌產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠芯片上的表達及檢測。研究發(fā)現(xiàn),利用瓊脂糖凝膠制作的微孔陣列芯片能夠快速捕獲、固定細菌;在滿足細菌正常生長的同時,不影響細菌產(chǎn)物的表達,能夠滿足利用熒光對相應產(chǎn)物進行檢測,從而實現(xiàn)利用熒光響應來篩選微生物。2、選用微流控芯片常用材料PDMS發(fā)展了一種新穎多孔材料,用于微生物高效固定。探討了水乳化法在低溫下聚合形成PDMS材料,并利用液體石蠟油作為稀釋劑,促進水在PDMS溶液中的乳化,減少乳化水滴的蒸發(fā);經(jīng)固化,可以得到具有很好的彈性和多孔性的多孔材料。研究發(fā)現(xiàn),該方法合成的PDMS多孔材料,能夠?qū)崿F(xiàn)對微生物的高效固定。3、構(gòu)建了一種表面結(jié)構(gòu)化的PDMS多孔材料模具,用于高效控制細菌纖維素自組裝形成圖案化細菌纖維素。利用微流控芯片常用的軟光刻技術(shù),制作了表面結(jié)構(gòu)化多孔材料圖案模具;結(jié)合細菌纖維素纖維在氣液交界面合成的特點,在細菌培養(yǎng)界面引入多孔性的圖案模具,用于表面圖案化細菌纖維素生物制造。研究發(fā)現(xiàn),利用軟光刻技術(shù)能夠很好地在PDMS多孔材料底部表面形成圖案,該模具能夠控制細菌纖維素纖維自組裝,快速地形成具有高精度的表面圖案化細菌纖維素。4、發(fā)展了一種中空結(jié)構(gòu)的PDMS多孔材料模具,用于控制細菌纖維素纖維自組裝形成復雜三維(3D)形狀細菌纖維素。利用失蠟法技術(shù),制作了具有精細結(jié)構(gòu)的、中空的多孔材料模具;結(jié)合細菌纖維素纖維在氣液交界面合成的特點,在細菌培養(yǎng)界面引入中空的模具,利用中空模具內(nèi)部的結(jié)構(gòu)精確控制細菌纖維素纖維自組裝,形成復雜3D形狀的細菌纖維素。研究發(fā)現(xiàn),失蠟法能夠制造出結(jié)構(gòu)復雜的、中空的多孔材料模具;該模具可以控制細菌纖維素纖維有序生長,形成耳朵、頸椎骨等復雜三維形狀的細菌纖維素,該3D細菌纖維素有望進一步應用于器官移植的研究。綜上所述:本文結(jié)合微流控可以靈活、精確鑄造微結(jié)構(gòu)的技術(shù)優(yōu)勢,利用微流控制造常用的瓊脂糖凝膠和PDMS硅膠材料,實現(xiàn)了微生物高通量篩選、高效固定以及細菌纖維素表面圖案化和三維形狀的生物制造。這些嘗試為微生物的深度工程化應用提供了新的技術(shù)方法平臺。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文大多數(shù)微生物細胞具有較小的體積（微生物大小一般為微米級），較，這就決定了微生物細胞具有較大的代謝廢物排泄、營養(yǎng)吸收和信息微生物細胞吸收多，轉(zhuǎn)化快，能夠快速將吸收營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)產(chǎn)各種酶、化學制劑以及生物材料提供了物質(zhì)基礎。生長繁殖速度快，微生物生長到固定大小以二分裂的方式進行繁殖[1件下，微生物能夠快速生長繁殖，其數(shù)量每 9.8 分鐘就會翻倍一次[7]。適應性強、容易發(fā)生基因變異。微生物對環(huán)境適應能力極強，深海、都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了微生物菌株；由于個體較小，結(jié)構(gòu)簡單，微生物非常容件變化產(chǎn)生變異，比如生物誘變劑和紫外線；這為培育新的微生物菌的條件，例如營養(yǎng)缺陷型、高產(chǎn)型菌株的培育。

提取的蛋白質(zhì)，可以作為人類基本飲食中蛋白質(zhì)的補充，代替?zhèn)鹘y(tǒng)昂貴的源，緩解蛋白質(zhì)短缺的問題[24]。目前單細胞蛋白已經(jīng)作為食品蛋白廣泛用人類的飲食當中。芽孢桿菌屬，氫單胞菌屬和甲基單胞菌屬中的多種菌株工業(yè)規(guī)模上用于生產(chǎn)單細胞蛋白，因為粗蛋白含量占這些細菌干重的比例24]。利用微生物獲得食品、食品添加劑甚至利用微生物生物質(zhì)作為食品的為食品加工產(chǎn)業(yè)重新煥發(fā)了活力。使傳統(tǒng)食品加工業(yè)看到了新的可能，例質(zhì)地和香味甚至新的食物[2]。.2 微生物與化學制劑日益增加的氣候變化和環(huán)境問題促使工業(yè)生產(chǎn)從化石燃料消費轉(zhuǎn)向可再使得利用可再生的生物質(zhì)生產(chǎn)化學制品的研究再次興起[25-27]。通過微生物化學制品，來減少能源生產(chǎn)對化石燃料的依賴是迫切需要的，特別是利用碳源進行生產(chǎn)（圖 3-1）。

8圖 1-4 用于心臟生物標志物檢測的硅納米線體系[42]。Figure 1-4 Silicon nanowire system for cardiac biomarker detection.[42]硅：硅是用于微流控的第一種材料，隨后很大層度上被玻璃和聚合物所取硅（玻璃）材質(zhì)的微結(jié)構(gòu)主要利用蝕刻、雕刻以及金屬或化學的蒸發(fā)沉積（圖 1-4）。硅具有高的彈性模量（130-180 GPa），不適合制作主動的流體和泵。硅具有豐富的硅羥基化學表面，所以很容易通過硅烷進行改性。例學修飾的硅表面，可以降低非特異性吸附和改善細胞的生長[44]。硅對能透而不能透過可見光，所以傳統(tǒng)的熒光檢測和流體成像在硅材質(zhì)的微流控裝困難。這些問題可以由透明性質(zhì)的材料來解決，例如，玻璃和聚合物。玻璃：繼硅之后，玻璃逐漸成為制作微流控裝置的材料。玻璃材料的微結(jié)
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本文編號：2874790