皮膚由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成,是人體對(duì)抗外部環(huán)境的一層天然保護(hù)屏障。當(dāng)皮膚遭到機(jī)械損傷、化學(xué)品危害以及細(xì)菌真菌侵入時(shí),人體就會(huì)失去這層保護(hù)屏障,機(jī)體也會(huì)啟動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)皮膚功能恢復(fù)。針對(duì)不規(guī)則、大面積以及深淺不一的皮膚創(chuàng)傷,目前的主要治療策略為采用網(wǎng)狀移植或者組織工程產(chǎn)品的異體或異種脫細(xì)胞基質(zhì)敷料進(jìn)行移植,其具有較低的免疫原性和良好的組織相容性,機(jī)械性與正常皮膚極其相近,是理想的生物輔料,但敷料與深淺不一的損傷部位貼合性不佳,容易造成空腔,使得并發(fā)癥的發(fā)生率提高。因此,本課題中,我們通過(guò)一種創(chuàng)新的細(xì)胞噴灑裝置,用于進(jìn)行細(xì)胞噴霧移植促進(jìn)損傷后的表皮再生,形成一種特殊形式的組織工程皮膚。結(jié)合交叉學(xué)科優(yōu)勢(shì),自主研發(fā)同時(shí)可以裝載自體皮膚細(xì)胞和脫細(xì)胞豬皮基質(zhì)粉的噴灑裝置用于皮膚創(chuàng)傷治療。探討細(xì)胞噴灑系統(tǒng)作為組織工程產(chǎn)品對(duì)皮膚損傷修復(fù)的意義。因此,本課題可分解為三個(gè)部分。第一部分中,我們重點(diǎn)評(píng)估了細(xì)胞噴灑裝置對(duì)于細(xì)胞的影響,驗(yàn)證了皮膚噴槍的優(yōu)勢(shì)與可應(yīng)用性;第二部分重點(diǎn)在于通過(guò)建立一種溫和、高效的原代表皮干細(xì)胞(human keratinocytes stem cells,hKSCs)分離方法,構(gòu)建足以使體外規(guī)�；瘮U(kuò)增的三維培養(yǎng)方案,提供足夠數(shù)量的種子細(xì)胞;第三部分,通過(guò)體外生物酶解和冷凍機(jī)械研磨方法,獲得高純度且保留生物活性的脫細(xì)胞豬皮細(xì)胞外基質(zhì)粉末(Decellular porcine skin extracellular matrix powder,ECMP)制備,作為細(xì)胞移植的液體載體促進(jìn)表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞參與損傷修復(fù),同時(shí)探索ECMP對(duì)表皮和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的支持作用及兩者對(duì)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的促進(jìn)作用。1.細(xì)胞搭載噴槍的生物學(xué)檢測(cè)我們?cè)O(shè)計(jì)不同類(lèi)型細(xì)胞裝載噴灑,證明噴灑過(guò)程對(duì)于細(xì)胞數(shù)量、分布和活性并沒(méi)有影響,噴灑過(guò)程對(duì)細(xì)胞功能執(zhí)行不會(huì)產(chǎn)生影響。確定了噴灑裝置通過(guò)Live/Dead染色以及免疫熒光等結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),噴灑裝置可以實(shí)現(xiàn)霧化效果,液滴均勻化分布;噴灑后液滴內(nèi)的細(xì)胞具有高活性,并隨著霧化效果同樣均勻分布。對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型與不同濃度的細(xì)胞外基質(zhì)重懸到一起后裝載噴灑后,結(jié)果顯示,細(xì)胞可以快速粘附并伸展。2.表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞儲(chǔ)備我們摸索創(chuàng)新了快速、溫和酶組合的消化方法,可以得到具有高活性的表皮干細(xì)胞。建立了一種對(duì)表皮干細(xì)胞進(jìn)行無(wú)滋養(yǎng)層、無(wú)血清的三維培養(yǎng)體系,結(jié)果表明,體外擴(kuò)增6代以?xún)?nèi)的倍增時(shí)間穩(wěn)定維持在52小時(shí)左右,為后期進(jìn)入臨床的細(xì)胞移植得到足夠數(shù)量的表皮細(xì)胞。這樣培養(yǎng)方式下擴(kuò)增起來(lái)的表皮干細(xì)胞活力狀態(tài)非常好,通過(guò)透射電鏡結(jié)果可以清楚看到分泌小泡,以及大量形成了具有表皮特有的橋粒連接。組織學(xué)結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞球高表達(dá)再生相關(guān)蛋白K14、增殖蛋白P63、Ki67以及上皮細(xì)胞連接E-cad、Claudin1。對(duì)表皮干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)鑒定發(fā)現(xiàn),細(xì)胞裝載噴灑后可以在體外形成假?gòu)?fù)層;經(jīng)鑒定,復(fù)層的最下面一層細(xì)胞高表達(dá)再生標(biāo)志蛋白ITGA6、K14,說(shuō)明了噴灑后的細(xì)胞在體外非常好地執(zhí)行增殖分化功能。在NOD/SCID全免疫缺陷小鼠的背部建立全層切除皮膚傷口模型,損傷后將富含表皮干細(xì)胞的細(xì)胞聚集體裝載皮膚噴槍并均勻噴灑于創(chuàng)面局部,移植治療后觀(guān)察細(xì)胞在傷口處的歸巢和整合。NOD/SCID小鼠的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證明,分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞噴灑傷口后,在第7天與對(duì)照組相比就開(kāi)始明顯快速恢復(fù),證明移植的細(xì)胞具有高活性并在體外存活時(shí)間長(zhǎng),分泌刺激傷口加速愈合。3.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)搭載噴灑裝置促表皮和成纖維細(xì)胞參與創(chuàng)傷修復(fù)經(jīng)過(guò)生物酶法脫細(xì)胞、冷凍干燥后-80℃保存?zhèn)溆?經(jīng)過(guò)不同冷凍研磨程序得到ECMP,再由鉆-60輻照獲得無(wú)菌基質(zhì)粉;通過(guò)觀(guān)察ECMP顆粒分布特性,確定適合應(yīng)用的冰凍研磨程序;通過(guò)研究不同濃度ECMP對(duì)細(xì)胞的促黏附作用,確定ECMP的使用濃度范圍;通過(guò)檢測(cè)ECMP對(duì)成纖維細(xì)胞的促遷移和對(duì)表皮細(xì)胞的促增殖作用,證實(shí)ECMP對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的重要作用;通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面成熟與分化蛋白的表達(dá),分析在與ECMP共培養(yǎng)時(shí),原代表皮角質(zhì)細(xì)胞成熟及干性維持的水平。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本課題所使用的噴灑裝置,在噴灑后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響做了全面細(xì)致的研究,驗(yàn)證了噴灑過(guò)程不僅對(duì)細(xì)胞的活力無(wú)影響,對(duì)細(xì)胞在體外增殖、分化和遷移等功能的發(fā)揮也無(wú)影響。確保了建立的細(xì)胞移植系統(tǒng)順利使用推廣。對(duì)分離培養(yǎng)獲得的表皮干細(xì)胞(hKSCs)的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定表明細(xì)胞在體外同樣具有擴(kuò)增潛能,為規(guī)模化擴(kuò)增奠定基礎(chǔ)。同時(shí),做到了完善的無(wú)血清、無(wú)滋養(yǎng)層的三維培養(yǎng)條件;使用臨床級(jí)別Knockout SR作為血清替代物,穩(wěn)定獲得功能完善的細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)在傷口恢復(fù)過(guò)程中可以最大限度的保留細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)分泌的各種營(yíng)養(yǎng)因子隨著細(xì)胞增殖遷移,創(chuàng)面再表皮化加速。本課題摸索建立后發(fā)現(xiàn),在冷凍研磨程序7次循環(huán)下,獲得的ECMP粒徑均小于15μm,可達(dá)到應(yīng)用的要求,ECMP以500 μg/cm2濃度包被培養(yǎng)板,能夠顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移,并且促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖并維持其干性。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R318
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果??１．噴灑裝置噴灑性能檢測(cè)??前言提到了通過(guò)皮膚組織工程進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)，具體設(shè)計(jì)如圖１－１，表皮單位??的體外擴(kuò)增后，重懸在細(xì)胞外基質(zhì)（ＥＣＭ）裝載皮膚噴槍?zhuān)妱?dòng)方式噴灑并完??全覆蓋住不規(guī)則創(chuàng)傷面，填充不同深度的組織中。ＥＣＭ促細(xì)胞活力，提供支撐，??創(chuàng)造細(xì)胞快速遷移以及加速信號(hào)傳遞微環(huán)境。ＥＣＭ的存在最大的優(yōu)勢(shì)是在傷口??恢復(fù)過(guò)程中可以最大限度的保留細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)分泌的各種營(yíng)養(yǎng)因子隨著細(xì)胞增殖??遷移，創(chuàng)面再表皮化完全。??．?ｊ?．皮槍?．．．．表皮單位＋ＥＣＭ??電也：便攜性?＿??１Ｊ?Ｖ??惠?ＴＯｅｃｍ??「１?椒?ｆ—?１—＾??＇不規(guī)則創(chuàng)面??＊＊?—??抆杈單怔?ｙ?瑯懸細(xì)胞＋ＥＣＭ?ｔｆ殯分化的細(xì)胞群??增殖、遷移和分化??、????圖１－１建立一種新型靈活的細(xì)胞移植系統(tǒng)用于創(chuàng)傷修復(fù)??噴灑的液滴尺寸是衡量噴灑設(shè)備性能的一個(gè)重要因素，與注射器（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）??相比較，分別噴灑ＰＢＳ溶液、ＨａＣａＴ細(xì)胞懸液，在顯微鏡下觀(guān)察液滴粒徑、細(xì)??胞分布。從圖１－２的結(jié)果可以看到噴槍的液滴直徑在５０＃ｎ左右，大小一致、細(xì)??第１０貞??

－??ＢＨＫ??圖１－２噴灑液滴霧化效果、均勻程度的對(duì)比??上面兩張為明場(chǎng)下噴槍?zhuān)ǎ樱穑颍幔┖妥⑸淦鳎ǎ桑睿辏澹悖簦铮颍﹪姙ⅲ校拢拥囊旱未笮�，�?biāo)尺為ｌｍｎｉ：??下圖為ＨａＣａＴ細(xì)胞系用ＤＡＰＩ染核之后分別噴灑的熒光圖。??對(duì)噴槍性能檢驗(yàn)的另一因素是噴灑范圍與均勻度的關(guān)系，ＨａＣａＴ細(xì)胞用??Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色Ｊｒｉ裝載噴槍垂直噴灑，如圖１－３所示ａ、ｂ、ｃ三個(gè)［Ｘ域內(nèi)細(xì)胞數(shù)??相差不人，ｉｌＥ明細(xì)胞的分布具Ｗ很好的均勻性。??ａ?ｂ?ｃ?ａ：?０－２?ｃｍ??＜?￣?ｍ?？?ｂ：?２－４?ｃｎｉ??ｃ：?４－６?ｃｍ??■■■??圖１－３噴灑范圍內(nèi)細(xì)胞的均勻分布熒光圖??第１１貞??

張為明場(chǎng)下噴槍?zhuān)ǎ樱穑颍幔┖妥⑸淦鳎ǎ桑睿辏澹悖簦铮颍﹪姙ⅲ校拢拥囊旱未笮�，�?biāo)尺為ｌＨａＣａＴ細(xì)胞系用ＤＡＰＩ染核之后分別噴灑的熒光圖。??對(duì)噴槍性能檢驗(yàn)的另一因素是噴灑范圍與均勻度的關(guān)系，ＨａＣａＴ細(xì)Ｄｅａｄ染色Ｊｒｉ裝載噴槍垂直噴灑，如圖１－３所示ａ、ｂ、ｃ三個(gè)［Ｘ域內(nèi)細(xì)不人，ｉｌＥ明細(xì)胞的分布具Ｗ很好的均勻性。??ａ?ｂ?ｃ?ａ：?０－２?ｃｍ??＜?￣?ｍ?？?ｂ：?２－４?ｃｎｉ??ｃ：?４－６?ｃｍ??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Abu Bakar Mohd Hilmi;Ahmad Sukari Halim;;Vital roles of stem cells and biomaterials in skin tissue engineering[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

本文編號(hào)：2873993