目的:研究肝素-透明質(zhì)酸-肝臟細胞外基質(zhì)水凝膠(HP-HA-肝ECM水凝膠)的制備方法及細胞相容性。方法:切取新鮮大鼠肝臟組織,使用凍融法、TritonX-100洗滌及胃蛋白酶溶解結(jié)合機械震蕩法進行脫細胞制備,HE染色法及DAPI染色法對其脫細胞效果進行檢測。將脫細胞后的肝臟ECM交聯(lián)肝素-透明質(zhì)酸水凝膠,制備HP-HA-肝ECM水凝膠。利用CCK8法和Live/Dead細胞染色法進行HP-HA-肝ECM水凝膠與下頜下腺細胞相容性檢測。結(jié)果:HP-HA-肝ECM水凝膠使下頜下腺細胞增殖活性升高,死細胞比率降低。結(jié)論:HP-HA-肝ECM水凝膠支架材料具有良好的細胞相容性。
【部分圖文】：

圖1肝臟脫細胞前后的比較(×100)Fig1Comparisonofthelivertissuebeforeandafterdecellulariza-tion(×100)經(jīng)過脫細胞化、凍干、冰凍研磨、胃蛋白酶溶解后得到的膠狀肝ECM成分(圖2A)。該成分外觀通透，無肉眼可見雜質(zhì)，無明顯異味(圖2B)。成品肝素－透明質(zhì)酸水凝膠，初始為均質(zhì)白色固態(tài)，待完全溶解后為透明狀液體。將兩者交聯(lián)得到HP-HA-肝ECM水凝膠，無色無味透明狀，稍黏稠，30min完全成為凝膠狀態(tài)(圖2C)，分別包被于96孔板和48孔板中(圖2D～E)。2．3新生SD大鼠下頜下腺細胞的形態(tài)學特征原代培養(yǎng)第3天可見典型的上皮細胞貼壁，第4天時可見少量成纖維細胞，采用差速貼壁法去除成纖維細胞后可得到形態(tài)較為一致的下頜下腺細胞，第5天時于顯微鏡下觀察見細胞呈多角形，邊界清晰，排列呈鵝卵石樣外觀;培養(yǎng)至第14天時，可見細胞排列緊密，呈鋪路石狀，胞漿豐富，可見分泌顆粒(圖3)。培養(yǎng)第14天時第1次傳代。圖2肝ECM成分的獲取及交聯(lián)Fig2Thepreparationofliverdecellularizedextracellularmatrixandcrosslink圖3原代培養(yǎng)的SD大鼠下頜下腺細胞形態(tài)(A:×200;B:×400)Fig3PrimarylyculturedsubmandibularglandcellsofSDrat(A:×200;B:×400)2．4體外培養(yǎng)SD大鼠下頜下腺細胞免疫學鑒定以α-淀粉酶和CK7作為下頜下腺細胞的標記蛋白。α-淀粉酶和CK7陽性表達的表現(xiàn)是下頜下腺細胞胞膜及胞質(zhì)呈綠色熒光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫熒光染色和CK7免疫細胞化學染色結(jié)果PBS液作為陰性對照。第2代SD大鼠下頜下腺細胞陽性表達α-淀粉酶、CK7標記蛋白。對照組結(jié)果陰性(圖4)。圖4SD大鼠下頜下腺細胞α-淀粉酶和CK7免疫學鑒定(×400)Fig4Immunologicalidentificationofα-amylaseandCK7inSMGCs(×400)2．5下頜下腺細胞在HP-HA-肝ECM水

圖1肝臟脫細胞前后的比較(×100)Fig1Comparisonofthelivertissuebeforeandafterdecellulariza-tion(×100)經(jīng)過脫細胞化、凍干、冰凍研磨、胃蛋白酶溶解后得到的膠狀肝ECM成分(圖2A)。該成分外觀通透，無肉眼可見雜質(zhì)，無明顯異味(圖2B)。成品肝素－透明質(zhì)酸水凝膠，初始為均質(zhì)白色固態(tài)，待完全溶解后為透明狀液體。將兩者交聯(lián)得到HP-HA-肝ECM水凝膠，無色無味透明狀，稍黏稠，30min完全成為凝膠狀態(tài)(圖2C)，分別包被于96孔板和48孔板中(圖2D～E)。2．3新生SD大鼠下頜下腺細胞的形態(tài)學特征原代培養(yǎng)第3天可見典型的上皮細胞貼壁，第4天時可見少量成纖維細胞，采用差速貼壁法去除成纖維細胞后可得到形態(tài)較為一致的下頜下腺細胞，第5天時于顯微鏡下觀察見細胞呈多角形，邊界清晰，排列呈鵝卵石樣外觀;培養(yǎng)至第14天時，可見細胞排列緊密，呈鋪路石狀，胞漿豐富，可見分泌顆粒(圖3)。培養(yǎng)第14天時第1次傳代。圖2肝ECM成分的獲取及交聯(lián)Fig2Thepreparationofliverdecellularizedextracellularmatrixandcrosslink圖3原代培養(yǎng)的SD大鼠下頜下腺細胞形態(tài)(A:×200;B:×400)Fig3PrimarylyculturedsubmandibularglandcellsofSDrat(A:×200;B:×400)2．4體外培養(yǎng)SD大鼠下頜下腺細胞免疫學鑒定以α-淀粉酶和CK7作為下頜下腺細胞的標記蛋白。α-淀粉酶和CK7陽性表達的表現(xiàn)是下頜下腺細胞胞膜及胞質(zhì)呈綠色熒光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫熒光染色和CK7免疫細胞化學染色結(jié)果PBS液作為陰性對照。第2代SD大鼠下頜下腺細胞陽性表達α-淀粉酶、CK7標記蛋白。對照組結(jié)果陰性(圖4)。圖4SD大鼠下頜下腺細胞α-淀粉酶和CK7免疫學鑒定(×400)Fig4Immunologicalidentificationofα-amylaseandCK7inSMGCs(×400)2．5下頜下腺細胞在HP-HA-肝ECM水

水凝膠，初始為均質(zhì)白色固態(tài)，待完全溶解后為透明狀液體。將兩者交聯(lián)得到HP-HA-肝ECM水凝膠，無色無味透明狀，稍黏稠，30min完全成為凝膠狀態(tài)(圖2C)，分別包被于96孔板和48孔板中(圖2D～E)。2．3新生SD大鼠下頜下腺細胞的形態(tài)學特征原代培養(yǎng)第3天可見典型的上皮細胞貼壁，第4天時可見少量成纖維細胞，采用差速貼壁法去除成纖維細胞后可得到形態(tài)較為一致的下頜下腺細胞，第5天時于顯微鏡下觀察見細胞呈多角形，邊界清晰，排列呈鵝卵石樣外觀;培養(yǎng)至第14天時，可見細胞排列緊密，呈鋪路石狀，胞漿豐富，可見分泌顆粒(圖3)。培養(yǎng)第14天時第1次傳代。圖2肝ECM成分的獲取及交聯(lián)Fig2Thepreparationofliverdecellularizedextracellularmatrixandcrosslink圖3原代培養(yǎng)的SD大鼠下頜下腺細胞形態(tài)(A:×200;B:×400)Fig3PrimarylyculturedsubmandibularglandcellsofSDrat(A:×200;B:×400)2．4體外培養(yǎng)SD大鼠下頜下腺細胞免疫學鑒定以α-淀粉酶和CK7作為下頜下腺細胞的標記蛋白。α-淀粉酶和CK7陽性表達的表現(xiàn)是下頜下腺細胞胞膜及胞質(zhì)呈綠色熒光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫熒光染色和CK7免疫細胞化學染色結(jié)果PBS液作為陰性對照。第2代SD大鼠下頜下腺細胞陽性表達α-淀粉酶、CK7標記蛋白。對照組結(jié)果陰性(圖4)。圖4SD大鼠下頜下腺細胞α-淀粉酶和CK7免疫學鑒定(×400)Fig4Immunologicalidentificationofα-amylaseandCK7inSMGCs(×400)2．5下頜下腺細胞在HP-HA-肝ECM水凝膠中的增殖情況實用口腔醫(yī)學雜志(JPractStomatol)2019Nov，35(6)·187·
【參考文獻】

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