背景當(dāng)今社會(huì),許多患者都飽受下腰痛的困擾。下腰痛不但降低患者生活質(zhì)量,使患者喪失勞動(dòng)能力,也過多消耗著有限的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)資源。研究表明,椎間盤退變(intervertebraldiscdegeneration,IDD)是造成下腰痛的主要原因之一。目前治療腰椎間盤退變的主要方法分為保守治療和手術(shù)治療兩種。然而,以藥物理療為主的保守治療只能減輕患者疼痛,無法阻止椎間盤的退變進(jìn)程;作為保守治療無效后的首選治療手段,手術(shù)治療的療效雖較為持久,但術(shù)后復(fù)發(fā)及相鄰階段退變問題使患者備受困擾。通過增強(qiáng)椎間盤內(nèi)細(xì)胞自身修復(fù),延緩椎間盤退變成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)7(bone morphogenetic protein7,BMP-7)即成骨蛋白-1(osteogenicprotein-1,OP-1),可促進(jìn)髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖和II型膠原,還可促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖以及向軟骨細(xì)胞分化。然而,BMP-7作為生長因子單獨(dú)使用時(shí),其半衰期較短,需要多次注射才能維持作用,且椎間盤內(nèi)直接注射BMP-7還存在成骨風(fēng)險(xiǎn)。新型自組裝多肽納米纖維支架材料RADA16-I(AcN-RAD ARAD ARAD ARADA-CNH)可將具有不同功能的生物活性多肽短片段復(fù)合在其C端末端,從而提高其生物學(xué)活性。本研究前期將具有BMP-7功能的短多肽片段(KPSSAPTQLN)通過化學(xué)鍵方式結(jié)合在RADA16-I的C端,從而構(gòu)建出功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADA-KPSS,再通過將RADA-KPSS與RADA16-I以1:1比例混合,形成新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADKPS。研究表明,RADKPS在體外可明顯促進(jìn)退變髓核細(xì)胞中蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成,且持續(xù)時(shí)間顯著長于單體BMP-7。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)證明,RADKPS具有良好的細(xì)胞相容性、血液相容性及組織相容性。為進(jìn)一步探索RADKPS在椎間盤退變中所起到的延緩和修復(fù)能力,本研究在低溫下將RADKPS注射入椎間盤缺損退變的動(dòng)物模型中,并檢測(cè)其修復(fù)效果,為未來其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:1.建立犬椎間盤退變的模型。2.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察RADKPS延緩椎間盤退變的作用。方法:1.選取1歲齡健康的雜種犬(10-15 kg),進(jìn)行X線及核磁共振(MRI)檢查對(duì)椎間盤整體情況進(jìn)行評(píng)價(jià),篩選出無明顯脊柱畸形、椎間盤整體情況良好的16只犬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2.16只成年雜種犬,每只選取4個(gè)椎間盤(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)。穿刺制作椎間盤退變模型。L7-S1椎間盤作為正常對(duì)照組不作任何處理。3.犬退變椎間盤治療干預(yù):待椎間盤造模4周后,通過MRI檢查測(cè)定椎間盤髓核區(qū)域以及相對(duì)部位腦脊液的灰度值,計(jì)算相對(duì)灰度值指數(shù)(relative gray index,RGI),確認(rèn)造模后椎間盤相對(duì)灰度值RGI比造模前明顯下降,且均一良好,保證造模后四組間椎間盤(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)相對(duì)灰度值RGI無顯著差異(p0.05)。分組:L6-7 注射 BMP-7,L5-6 注射 RADKPS,L4-5 注射 PBS,L3-4注射不含活性方片段的RADA-16。4.在造模前4周,造模后4周,干預(yù)治療后4周、8周、12周均進(jìn)行MRI檢查測(cè)定椎間盤相對(duì)灰度值RGI。以干預(yù)手術(shù)的時(shí)間點(diǎn)定位0點(diǎn),時(shí)間依次記錄為-4w、0w、4w、8w、12w。在-4w、0w、12w進(jìn)行X線檢測(cè)測(cè)定椎間盤相對(duì)高度指數(shù)DHI%。5.組織學(xué)檢查:在12w,影像學(xué)檢查結(jié)束后采用注射氯胺酮將犬安樂死;將犬的L3至S1脊柱聯(lián)合周圍軟組織共同分離;將每一個(gè)椎間盤髓核組織給予石蠟包埋切片;分別進(jìn)行HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色和蛋白多糖免疫組化染色。6.生化成分檢測(cè):在12 w,采用注射氯胺酮將犬安樂死。將犬L3至S1脊柱聯(lián)合周圍軟組織共同分離;從椎間盤橫行切開;分離出髓核組織;通過ELISA蛋白定量檢測(cè)蛋白多糖及Ⅱ型膠原的含量。結(jié)果:1.在-4w時(shí),納入實(shí)驗(yàn)的椎間盤均一性良好,無先天退變。在Ow時(shí),各椎間盤(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)造模成功,均一性退變而正常對(duì)照組無退變。在12w時(shí)RGI值:正常對(duì)照組RADKPS組BMP-7組RADA-16組PBS 組(P0.05)。在 4w、8w、12w時(shí),BMP-7 組、RADA16-I 組、PBS組RGI值均隨著作用時(shí)間而降低(P0.05)。RADKPS實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組RGI值在相同時(shí)間周期內(nèi)并無顯著差異(P0.05)。2.X線:在-4w、0w和12w時(shí)進(jìn)行X線檢測(cè),L3到L7的4個(gè)椎間盤高度均有所下降;在12 w時(shí),椎間盤相對(duì)高度指數(shù)DHI%:正常對(duì)照組RADKPS組BMP-7 組RADA-16組PBS組(P0.05)。3.HE染色:正常對(duì)照組的髓核組織均一深度紅染,含有大量團(tuán)簇樣細(xì)胞,分布均勻;RADKPS實(shí)驗(yàn)組的髓核組織染色較為均一,可見少量團(tuán)簇樣細(xì)胞;BMP-7對(duì)照組與RADA16-I對(duì)照組的髓核組織團(tuán)簇樣細(xì)胞消失,髓核組織結(jié)構(gòu)紊亂;PBS對(duì)照組的髓核組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少,組織逐漸被膠原所取代。4.免疫組化染色:RADKPS實(shí)驗(yàn)組髓核組織蛋白多糖與Ⅱ型膠原深染,染色程度明顯高于BMP-7組,RADA-16組,PBS組。分別計(jì)算其平均光密度AOD值均顯示:正常對(duì)照組RADKPS實(shí)驗(yàn)組BMP-7對(duì)照組RADA-16對(duì)照組PBS對(duì)照組(P0.05)。5.Elisa蛋白定量檢測(cè)分析:蛋白多糖與Ⅱ型膠原均顯示:正常對(duì)照組RADKPS實(shí)驗(yàn)組BMP-7對(duì)照組RADA-16對(duì)照組PBS對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論在椎間盤退變?cè)缙?RADKPS多肽水凝膠具有延緩?fù)俗兊淖饔�。相較于直接注射RADA-16和BMP-7,RADKPS繼承了 RADA-16在椎間盤內(nèi)代謝緩慢,持久發(fā)揮作用的特性,且具有同BMP-7直接注射水平相當(dāng)?shù)牧己蒙锘钚浴Ｒ环矫?RADKPS的作用可能與其促進(jìn)椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原的機(jī)制有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.08;R681.53
【部分圖文】：

圖２－１為犬進(jìn)行手術(shù)前的準(zhǔn)備??Ａ．術(shù)前的備皮?Ｂ．術(shù)前的劃線??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?ｓｈｏｗｓ?ｔｈｅ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｏｇ?ｂｅｆｏｒｅ?ｓｕｒｇｅｒｙ??Ａ．Ｓｋｉｎ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｂｅｆｏｒｅ?ｓｕｒｇｅｒｙ?Ｂ．Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ?ｍａｒｋｉｎｇ??２．２椎間盤造模手術(shù)過程??采取速眠新鹽酸賽拉嗦注射液＼鹽酸氯胺酮注射液聯(lián)合肌肉注射的方法進(jìn)行??麻醉。按照每公斤體重０．３?ｍｌ鹽酸賽拉嗦注射液、０．４ｍｌ鹽酸氯胺酮注射液將兩??者混合，在犬大腿處，或者臀大肌處注射所需總量的２／３。在肌肉注射前需進(jìn)行??回抽，然后用木棍固定犬的上下頜，并將舌頭拽出，以免在麻醉過程中舌后墜，??發(fā)生室息。采取右側(cè)臥位，用綁帶固定住犬的頭部和四肢，頭部用繃帶固定犬尖??牙處，四肢需固定至肘關(guān)節(jié)以上部位，防止手術(shù)中動(dòng)物掙脫。于脛骨外側(cè)的脛骨??下動(dòng)脈建立靜脈通入。然后給與生理鹽水術(shù)中補(bǔ)液，防止犬術(shù)中體液丟失過多，??補(bǔ)液量２００?ｍｌ，在術(shù)中２?ｈ內(nèi)輸入完畢。同時(shí)在術(shù)中以０．３５?ｍｌ／ｋｇｈ的速度輸入??

Ｉ國瞧＾?％?％??ｎｐｐｎｐｐｐ?丨?ｌｉｉｉｉｉｉｉｐｐｐｍｐｉｉｐｉ！??＾ＹＷ?Ｓ９＇?１０！?１?１２?１??圖２－３手術(shù)過程中從椎間盤內(nèi)吸出的膠凍狀物質(zhì)－髓核組織。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｎｕｃｌｅｕｓ?ｐｕｌｐｏｓｕｓ，?ａ?ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，?ｗａｓ?ａｓｐｉｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ?ｄｉｓｃ??ｄｕｒｉｎｇ?ｓｕｒｇｅｒｙ．??１６??

?麵??圖２－２手術(shù)過程中進(jìn)行穿刺造模??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?ｐｕｎｃｔｕｒｅ?ｍｏｌｄｉｎｇ?ｗａｓ?ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ?ｄｕｒｉｎｇ?ｔｈｅ?ｏｐｅｒａｔｉｏｎ??Ｉ國瞧＾?％?％??ｎｐｐｎｐｐｐ?丨?ｌｉｉｉｉｉｉｉｐｐｐｍｐｉｉｐｉ！??＾ＹＷ?Ｓ９＇?１０！?１?１２?１??圖２－３手術(shù)過程中從椎間盤內(nèi)吸出的膠凍狀物質(zhì)－髓核組織。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｎｕｃｌｅｕｓ?ｐｕｌｐｏｓｕｓ，?ａ?ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，?ｗａｓ?ａｓｐｉｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ?ｄｉｓｃ??ｄｕｒｉｎｇ?ｓｕｒｇｅｒｙ．??１６??
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本文編號(hào)：2850583