引導(dǎo)骨組織再生(Guide bone regeneration, GBR)是近年發(fā)展起來的一項促進(jìn)組織再生愈合的新理論和新技術(shù)。它指利用膜的機(jī)械屏障作用,阻止病損區(qū)周圍生長較快的其它組織細(xì)胞長入病損區(qū),消除其它組織細(xì)胞的競爭性抑制作用,選擇性引導(dǎo)特定細(xì)胞向病損的部位附著、增生,促進(jìn)病損的修復(fù)。近年,種子細(xì)胞和生物活性因子的加入,復(fù)合化和功能化的GBR膜具有更好的引導(dǎo)骨組織再生作用。目前以天然衍生牛心包為基礎(chǔ)制備復(fù)合功能GBR膜的研究較少,本研究分四個部分,首先以天然牛心包為來源通過脫細(xì)胞處理和交聯(lián)處理制備出符合引導(dǎo)骨組織再生技術(shù)要求的天然衍生GBR膜；第二部分進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)不同方向誘導(dǎo)培養(yǎng)和BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs實驗研究,為下一步復(fù)合GBR膜的研究打下基礎(chǔ)；第三部分將天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜與BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs體外復(fù)合,檢測其生物相容性和細(xì)胞增殖等情況,為下一步動物實驗打下基礎(chǔ)；第四部進(jìn)行天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs引導(dǎo)骨組織再生的初步動物實驗研究,探討脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs臨床上引導(dǎo)骨組織再生、修復(fù)骨缺損的可行性。 第一章天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜的制備 目的：篩選出一種比較理想的天然衍生牛心包脫細(xì)胞處理和交聯(lián)處理方法,為制備出符合臨床要求的GBR膜材料打下基礎(chǔ)。 方法： 1.天然牛心包膜采用胰酶去垢劑法(Ⅰ),胰酶核酸酶法(Ⅱ),胰酶去垢劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅲ),凍融后去污劑法(IV),凍融后核酸酶法(V),凍融后去污劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅵ)進(jìn)行脫細(xì)胞處理,通過光鏡、掃描電鏡觀察,細(xì)胞毒性實驗,機(jī)械性能測定,細(xì)胞趨化性實驗等,篩選出最佳脫細(xì)胞處理方法。 2.天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜采用戊二醛和京尼平對其進(jìn)行交聯(lián)處理,通過光鏡、掃描電鏡觀察,厚度檢測,機(jī)械性能檢測,交聯(lián)指數(shù)測定,體外降解以及細(xì)胞毒性試驗等,篩選出最理想脫細(xì)胞牛心包膜交聯(lián)方法。 結(jié)果： 1.脫細(xì)胞結(jié)果表明：凍融去污劑核酸酶聯(lián)合法處理后牛心包纖維排列致密有序,天然結(jié)構(gòu)保存良好,細(xì)胞毒性低,是最理想的脫細(xì)胞方法。 2.交聯(lián)結(jié)果表明：京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞牛心包膜比戊二醛交聯(lián)效果具有更好生物相容性,交聯(lián)效果好,是最理想的交聯(lián)方法。 結(jié)論：凍融去污劑核酸酶聯(lián)合法是制備脫細(xì)胞牛心包膜最理想的方法；京尼平交聯(lián)的脫細(xì)胞牛心包膜具有更好生物相容性。 第二章骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)多向誘導(dǎo)培養(yǎng)及BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs實驗研究 目的：探索兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)方法并對BMSCs誘導(dǎo),觀察其多向培養(yǎng)潛能；進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs實驗,為GBR復(fù)合膜研究打下基礎(chǔ)。 方法： 1.貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔BMSCs,相差顯微鏡觀察BMSCs的生長增殖情況；取生長狀態(tài)良好的第2代BMSCs,分別用成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),然后檢測BMSCs多向培養(yǎng)生長情況。 2.傳代培養(yǎng)良好的BMSCs,通過質(zhì)粒載體,采用電穿孔法轉(zhuǎn)染BMP-2基因,然后進(jìn)行下列鑒定：熒光顯微鏡觀察BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs生長增殖情況;RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的BMP-2mRNA表達(dá);Westeblot檢測BMP-2在蛋白水平的表達(dá)；ALP檢測評價其成骨分化能力。 結(jié)果： 1.兔原代及傳代BMSCs細(xì)胞生長良好；成骨誘導(dǎo)實驗ALP染色結(jié)果陽性,茜素紅染色陽性；成脂誘導(dǎo)實驗油紅O染色結(jié)果陽性；成軟骨誘導(dǎo)實驗Ⅰ型膠原和Aggrecan免疫化學(xué)染色陽性。 2.BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染效率為41.2士1.1%；RT-PCR結(jié)果表明BMP-2RNA表達(dá)陽性,Westernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染BMSCs可有效表達(dá)轉(zhuǎn)染基因；BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs的ALP活性明顯高于空白轉(zhuǎn)染組。 結(jié)論： 1.原代培養(yǎng)兔BMSCs具有多向生長能力,可成功誘導(dǎo)培養(yǎng)為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞。 2.BMP-2基因可有效成功轉(zhuǎn)染BMSCs,從而為下步復(fù)合GBR膜研究打下基礎(chǔ)。 第三章脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs引導(dǎo)骨再生的體外實驗研究 目的：探討脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs材料的生物相容性,細(xì)胞毒性及BMSCs在牛心包膜材料上的貼附、生長、增殖及成骨分化情況。 方法：脫細(xì)胞牛心包膜體外復(fù)合BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs,通過掃描電鏡評估細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包支架材料上的的貼附、生長與增殖情況,MTT檢測膜材料對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性,ELISA檢測BMP-2含量,結(jié)晶紫染色法測定BMSCs細(xì)胞粘附能力檢測, ALP活性實驗檢測轉(zhuǎn)染BMSCs成骨性能。 結(jié)果： 1.掃描電鏡結(jié)果表明：脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs后,細(xì)胞能良好的貼附并增殖。 2.細(xì)胞毒性檢測結(jié)果表明,各組細(xì)胞的存活率沒有明顯差異。 3.細(xì)胞粘附能力檢測結(jié)果表明：脫細(xì)胞牛心包膜增強(qiáng)了BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞粘附能力。 4.ALP活性檢測、Westernblot檢測和RT-PCR檢測結(jié)果表明：脫細(xì)胞牛心包膜增強(qiáng)了BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。 結(jié)論：脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs功能膜有良好的生物相容性和細(xì)胞相容性,可能具備更佳的引導(dǎo)骨再生能力。 第四章脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs引導(dǎo)骨再生的動物實驗研究 目的：將脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs構(gòu)建的功能膜植入兔下領(lǐng)骨骨缺損處,探討其引導(dǎo)骨組織再生情況。 方法：建立兔下頜骨骨缺損模型,分別植入BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs/脫細(xì)胞牛心包復(fù)合體(A組)、單純脫細(xì)胞牛心包材料(B組),同時設(shè)立空白對照(C組),分別于術(shù)后第4、8、12周行大體肉眼觀察,X線檢測和組織形態(tài)學(xué)檢測,觀察其成骨情況。 結(jié)果：大體肉眼觀察、X線檢測、組織形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果表明：術(shù)后第8周及第16周實驗組A,B組骨缺損愈合情況與C組(空白對照)有顯著差異,且A組優(yōu)于B組(p0.05)。 結(jié)論：脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs功能膜可更加有效促進(jìn)兔下頜骨骨缺損修復(fù)。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

原代BMSCs剛接種時，可見絕大多數(shù)

原代BMSCs培養(yǎng)7天，細(xì)胞分裂胞呈圓形漂浮于培養(yǎng)瓶中，少量細(xì)抱沉降到增殖并群落樣生長，可在培養(yǎng)瓶底見到多

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 周藝群,吳漢江;牛心包引導(dǎo)骨組織再生的實驗研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年05期

2 張國安;寧方剛;鐘京鳴;于東寧;趙南明;;脫細(xì)胞羊皮基質(zhì)的制備與性能檢測[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年47期

3 周藝群,吳漢江;三種GBR膜材料的比較研究[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年05期

4 韓雪峰,楊大平,郭鐵芳;曲拉通X-100對制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)影響的實驗研究[J];中華外科雜志;2002年01期

5 劉建，胡蘊玉，馬真勝，呂榮，劉新平，胡敏;骨折愈合過程中BMP_3基因表達(dá)的實驗研究[J];中華外科雜志;1996年10期

6 張子軍，盧世壁，王繼芳，張伯勛;骨缺損中內(nèi)源性BMP的分布及其作用[J];中華外科雜志;1996年10期

7 魏寬海,裴國獻(xiàn),鄭磊,王前,金丹,胡罷生;地塞米松對骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2001年04期

本文編號：2822678