臨床上常見牙周病、外傷、腫瘤、先天性唇腭裂形成的牙槽嵴裂等各種原因造成的不同程度、不同范圍的牙槽骨缺損,采取什么樣的治療方式,才能達到形態(tài)、功能和美觀的完美修復,這是口腔界的一大難題。目前主要采用骨移植手術對骨缺損部位進行修復。從修復效果看,使用自體骨進行移植修復無疑是首選方案,但自體骨移植手術會因取材,給患者帶來二次創(chuàng)傷。為減輕患者的創(chuàng)傷痛苦,臨床上采用同種異體骨、異種骨、以及金屬合金、高分子聚合物等人工骨作為代替材料進行移植修復,達到了一定的修復目的,但同時也需要面對相應的免疫排斥、組織相容、疾病交叉?zhèn)鞑�、以及材料生物學或力學性能等方面潛在的問題。骨組織工程為牙槽骨缺損的修復提供了新的方向。骨組織工程是將醫(yī)學原理與工程技術結(jié)合,在各種因子的誘導下,使接種于支架材料上的細胞不斷增殖,逐漸達到修復骨缺損的目的,其關鍵要素為細胞、支架、誘導因子。相關研究表明,骨髓間充質(zhì)細胞可在適宜的條件下分化成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等,是組織工程理想的種子細胞,但如何調(diào)控定向分化仍屬難題。生物玻璃在促進組織修復方面具有突出的理化性能,采用纖維沉積設備打印溶膠-凝膠型微納米生物活性玻璃三維多孔支架,可以在保證力學性能的前提下,通過微玻璃球堆疊自然形成微納米級孔隙,有利于促進細胞的黏附、遷移和分化,賦予生物活性玻璃支架更優(yōu)異的性能;同時纖維沉積技術避免了常規(guī)的熱熔,有利于保留材料的生物活性或可能添加的生物因子;3D打印可以制備具有特定幾何形狀、尺寸和內(nèi)部級孔結(jié)構多樣化的三維支架,以滿足臨床上的不同需求。殼聚糖(ChitosanCS)是一種具有生物特性的優(yōu)質(zhì)載體,神經(jīng)表皮生長因子樣蛋白-1(Nel-liketypeⅠmolecular-1,NELL1)是一個新型有效的成骨因子,其相關研究正在探索完善中。本實驗構建負載NELL-1的DNA(pDNA-NELLl)的CS納米粒,將此納米粒與3D打印的溶膠-凝膠型微納米生物活性玻璃(3D printed and sol-gel micro-nano bioactive glasses,BG)進行復合,以恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為種子細胞、pDNA-NELL1 作為誘導因子、BG為支架,復合構成組織工程骨材料,植入到已制備的恒河猴牙槽骨缺損區(qū)模型中,以評價該組織工程植骨材料的原位成骨能力,觀察BMSCs介導下基因修飾型微納米生物玻璃復合材料對恒河猴牙槽大面積骨缺損的再生修復效果,以及檢測再生部位牙槽骨的骨修復情況,以期為臨床上修復不同幾何形狀、不同尺寸大小的牙槽骨、乃至其他部位的骨缺損,提供一種更有效、可行的組織工程骨材料,使組織工程骨修復向個性化的發(fā)展邁出一大步。本實驗分為以下兩個部分:第一部分BMSCs介導3D打印微納米生物活性玻璃三維多孔支架復合NELL1-DNA組織工程骨材料的制備目的:構建和制備新型組織工程牙槽骨材料——BMSCs介導3D打印微納米生物活性玻璃三維多孔支架復合NELL1-DNA的組織工程骨(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs),并完成實驗分組。方法:1.本實驗中所用的3D打印微納米生物活性玻璃支架是由華南理工大學國家人體組織功能重建工程技術研究中心提供,針對本實驗的特殊性和要求,綜合采用溶膠-凝膠技術與有機模板自組裝技術制備介孔生物玻璃微球,以直徑為350 nm左右的生物活性玻璃微球為打印材料、聚乙烯醇為粘結(jié)劑,采用纖維沉積設備打印生物活性玻璃三維多孔支架,成功制備出10mm×10mm×5mm長方體生物玻璃支架,孔徑長寬為250 μm,并在支架表面涂覆高濃度PBS緩沖液和海藻酸鈉磷酸鹽復合液形成K3CaH(P04)2沉積表面,以最大程度的增強生物活性玻璃支架材料的抗壓強度,并具有良好的體外磷灰石形成活性。該生物活性玻璃支架能夠提供骨組織修復過程中促進骨細胞增殖需要的微孔尺寸在150-500 μ m范圍內(nèi)、孔隙率不小于40%的連通多孔的三維環(huán)境,且具有良好的生物活性和可降解性,其相關性能該研究中心已做過完善的實驗及研究并已發(fā)表成果。2.培養(yǎng)恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs):穿刺抽取恒河猴骨髓,將其放在含有10%的胎牛血清和1%的雙抗的DMEM/F12的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),使骨髓組織貼壁生長,收集傳代培養(yǎng)第3、4代細胞。顯微鏡下觀察BMSCs的生長方式及形態(tài)學變化、染色實驗檢測BMSCs成骨分化能力,CCK-8實驗評價細胞增殖能力。3.制備殼聚糖包載pDNA-NELL1納米粒:將10g殼聚糖溶于360mL的NMP(1-甲基-2-吡略烷酮),攪拌下加入35mL15%NaOH、57.5mLCH3I。經(jīng)過沉淀獲取TMC。取0.4 mL pDNA-NELL1溶于骨涎蛋白溶液(BSP)中,配成濃度為0.5mg/mL的DNA溶液,將0.4mL此溶液加入離心管中,然后加入1.2mL濃度1mg/mL TMC的BSP溶液,混合震蕩后制備出N/P值為10的載pDNA-NELL1的納米顆粒溶液(CSn)。4.BMSCs介導3D打印溶膠-凝膠型生物活性玻璃三維支架復合NELL1組織工程骨材料的制備,實驗分組。所有支架均經(jīng)過預處理,準備濃度為1mg/mL的殼聚糖溶液、濃度為5×106 cells/mL的BMSCs細胞懸浮液,開始分組制備組織工程骨。實驗分4組,對照組3組和實驗組。Ⅰ.對照組1(BG):220 μL生理鹽水滴加到BG支架上,浸潤4-6個小時,接著滴加200 μL生理鹽水(與下面各組滴加的細胞懸浮液等量)。Ⅱ.對照組2(BG+BMSCs):220 μL生理鹽水滴加到BG支架上,浸潤4-6個小時,接著滴加200 μL BMSCs細胞懸浮液。Ⅲ.對照組3(BG\CSn+BMSCs):先混合200 μL殼聚糖溶液和20 μL生理鹽水,渦旋震蕩30秒,將混合液220 μL滴加到BG支架上,浸潤4-6個小時,接著滴加200 μL BMSCs細胞懸浮液。Ⅳ.實驗組(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs):先混合200 μL殼聚糖溶液和20 μ L殼聚糖包載的pDNA-NELL1納米粒混合液,渦旋震蕩30秒,將此混合液220 μL滴加到BG支架上,浸潤4-6個小時,接著滴加200 μL BMSCs細胞懸浮液。上述操作步驟保障對照組2、3和實驗組的支架材料中均種有1 × 106個細胞。結(jié)果:1.電鏡下支架成微球狀排列,BG微球表明粗糙,BMSCs細胞粘附于支架。2.顯微鏡下觀察恒河猴BMSCs體外培養(yǎng)期細胞形態(tài)變化,細胞傳代至第三代時細胞呈紡錘樣,形成輻射或旋渦樣的緊密排列。堿性磷酸酶、茜素紅染色實驗均呈陽性,證明BMSCs在體外誘導成功向成骨細胞分化。3.成功制備大小為10mm×10mm×5mm組織工程牙槽骨材料,并分為4組,BG、BG+BMSCs、BG\CSn + BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs。結(jié)論:以恒河猴BMSCs作為種子細胞、NELL1作為細胞因子、3D打印的溶膠-凝膠型生物活性BG為支架,可制備出新型的BMSCs介導3D打印生物活性玻璃三維支架復合NELL1基因的組織工程牙槽骨骨材料。第二部分組織工程骨修復恒河猴牙槽骨缺損的動物實驗實驗一:動物實驗—恒河猴牙槽骨缺損模型的組織工程修復目的:恒河猴牙槽骨缺損模型的組織工程修復,用于檢測組織工程材料修復牙槽骨缺失模型的可行性,以及為后續(xù)觀察和評價組織工程牙槽骨的修復能力建造平臺。方法:1.建立牙槽骨缺損模型:4只成年雌性恒河猴,隨機編號A、B、C、D號,上下左右頜骨按照口腔國際區(qū)域編碼為1、2、3、4四個象限,共計16個牙槽骨實驗區(qū)。術前24小時禁食禁水,全身麻醉,消毒,分別拔除ABCD猴的四個象限的第一、二前磨牙,磨除拔牙窩周邊骨及頰側(cè)骨皮質(zhì),保留舌側(cè)的骨皮質(zhì),建立約10mm×10mm×5mm大小的、共計16個的牙槽骨缺損區(qū)。2.組織工程牙槽骨材料植入手術:在ABCD猴的4個牙槽骨缺損區(qū)分別隨機植入4種骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs),但保證每只恒河猴的每個牙槽骨缺損區(qū)植入的骨材料是不同的,以消除不同猴之間、不同牙槽骨缺損區(qū)之間的差異。植入組織工程骨后,缺損縫合,嚴密覆蓋植入的組織工程牙槽骨。3.術后行X光檢查,檢查植骨材料的植入情況。4.術后護理:牙齦縫合后局部消毒,術后2周給予軟食。術后連續(xù)7天全身用藥抗感染。術后每天兩次用2%洗必泰50 mL口腔沖洗和手術部位消毒,持續(xù)2周。5.術后觀察:ABCD猴的日�；顒�、飲食、情緒有無異常,傷口有無紅腫、滲出等炎癥反應,以及有無化膿、壞死等并發(fā)癥的發(fā)生。若無異常,2周后拆線。結(jié)果:1.在A、B、C、D猴的四個象限分別建立牙槽骨缺損模型,并將4種骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)分別成功植入牙槽骨缺損區(qū),每只猴的每個象限所植入的材料均不同。2.X光片示:ABCD猴的4個牙槽骨缺損區(qū)均有骨材料植入。3.術后2周加強護理,2周內(nèi)觀察到ABCD猴的日常活動、飲食、情緒無異常,傷口無紅腫、滲出等炎癥反應,無化膿、壞死等并發(fā)癥的發(fā)生。2周后拆線。結(jié)論:成功在ABCD猴的四個象限建立牙槽骨缺損模型,并將4種骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)分別植入牙槽骨缺損區(qū),術后兩周無炎癥反應和并發(fā)癥發(fā)生。實驗二:組織工程骨修復牙槽骨缺損動物實驗模型的評價目的:組織工程牙槽骨材料植入恒河猴牙槽骨缺損區(qū)術后12周,二次手術,觀察、檢測新型組織工程骨材料對恒河猴牙槽骨缺損的修復效果,評價其成骨性能。方法:1.植入材料術后12周,植骨區(qū)拍攝X光片。2.二次手術,術中觀察植骨區(qū),并取ABCD猴的四個象限的植骨區(qū)骨:術前24小時禁食禁水,全身麻醉,消毒,分別拔除ABCD猴的四個象限的尖牙,翻瓣后觀察植骨區(qū),然后取骨,取骨的范圍大于第一次手術的植骨區(qū),分離出15mm×12mm×7mm大小骨塊,標號。3.Micro-CT三維重建以觀測骨組織內(nèi)部的修復情況。4.組織學檢查:將標本置于10%甲醛水溶液中固定7天。共計16個骨標本。固定后包埋切片,HE染色。結(jié)果:1.X線結(jié)果:實驗組(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)顯示植骨材料與周邊骨界線不清,植骨材料幾乎被完全吸收改建,骨小梁結(jié)構清晰,數(shù)目較多,呈網(wǎng)狀結(jié)構均勻排列,骨皮質(zhì)比較均勻連續(xù),牙槽嵴高度比對照組都高,牙槽嵴頂高度幾乎與周邊自體骨相一致,植骨區(qū)呈大范圍的高密度阻射陰影區(qū)。對照組1(BG)顯示植骨材料與周邊骨界線較清楚。越接近周邊骨的材料吸收改建,可見稀松的骨小梁結(jié)構散在排列。近牙槽嵴頂可清晰看到植骨材料。對照組2(BG+BMSCs)顯示植骨材料與周邊骨界線不清,植骨材料幾乎被完全吸收改建,骨小梁結(jié)構清晰,但數(shù)目較少,散在排列。牙槽嵴頂呈U型,最凹處低于周圍自體骨高度。對照組3(BG\CSn+BMSCs)顯示植骨材料與周邊骨界線不清,植骨材料幾乎被完全吸收改建,骨小梁結(jié)果清晰,數(shù)目較少但比BG+BMSCs組多,散在排列。牙槽嵴頂呈U型,最凹處低于周圍自體骨高度,植骨區(qū)阻射陰影密度高于BG+BMSCs組。2.術中翻瓣后,肉眼可觀察到有新骨形成,新骨的大小和植入材料相類似,可觀察到新生骨與周圍正常骨組織分界不明顯,新骨表面較光滑平整沒有明顯的凹陷或者凸起,表面并有骨膜覆蓋。3.Micro-CT三維重建圖像顯示,實驗組和對照組都有新骨生成,實驗組比對照組骨小梁更加粗大,骨小梁排列更緊密,骨密度更高。BG組見骨小梁形成凌亂稀疏無規(guī)則,可觀察到有空洞形成。BG+BMSCs組和BG\CSn+BMSCs組植骨區(qū)骨小梁結(jié)構清晰,數(shù)量較多,均未發(fā)現(xiàn)空洞,新骨與周邊骨形成整合,觀察不到明顯界線,骨缺損愈合良好。4.組織切片HE顯示,實驗組(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)顯示新生骨組織與周邊骨完全融合,形成致密的新骨,有大量成熟的骨細胞。BG組新骨形成有大量的空腔和結(jié)締組織,骨細胞形成數(shù)量少,位置比較稀疏。BG+BMSCs組和BG\CSn+BMSCs組新骨密度、數(shù)量低于實驗組,但都高于BG組,空腔和結(jié)締組織的數(shù)量小于BG組。結(jié)論:構建的組織工程骨材料BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs植入恒河猴牙槽骨缺損區(qū)實驗中,肉眼、X-ray及Micro-CT觀察顯示新生骨量、密度、硬度、結(jié)構與正常骨極為接近,骨皮質(zhì)光滑與周邊正常骨連接緊密。組織學觀察顯示缺損區(qū)炎反應小,新生組織結(jié)果接近正常骨,有效促進恒河猴牙槽骨缺損的修復。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08;R782.1
【部分圖文】：

圖３：邋ＢＭＳＣｓ接種第８天的形態(tài)（細胞呈長梭形）逡逑

圖２：邋ＢＭＳＣｓ接種第４天的形態(tài)（細胞呈多角形）逡逑培養(yǎng)至第７－９天細胞融合至８５％左右時，細胞體積有所增大，細胞形態(tài)較均逡逑

Ａ邐ｘ邋１００邐Ｂ邐Ｘ２００逡逑圖１：邋ＢＭＳＣｓ提取第１天的形態(tài)（細胞呈圓形）逡逑胞ＢＭＳＣｓ體外培養(yǎng)在顯微鏡下的形態(tài)動態(tài)觀察逡逑，除去未貼壁生長的雜質(zhì)細胞。三天后可見在器皿壁出一－

【參考文獻】

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1 陳發(fā)明;;牙周組織工程與再生[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2017年10期

2 王芳;葛少華;;甲狀旁腺激素的成骨機制及其對顱頜面和牙周組織再生的研究進展[J];口腔醫(yī)學;2015年12期

3 張馨月;李焰;李晨軍;;頜面部及牙周組織工程骨的血管化和成骨策略[J];中國組織工程研究;2015年42期

4 孫素珍;曹正國;戴杰;吳志芳;;牙齦瘤切除術后的美學處理與分析[J];口腔醫(yī)學研究;2015年04期

5 郭天奇;周延民;趙靜輝;儲順禮;孫千月;羅雯靜;馬珊珊;;富血小板血纖蛋白與其他生物材料聯(lián)合用于牙周組織修復[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2015年02期

6 吳麗萍;宗文逸;時函;;再生的牙周組織在正畸壓應力下破骨相關因子表達的研究[J];口腔醫(yī)學;2014年09期

7 汪黎明;蔡展文;;牙周病松牙固定研究進展[J];中國美容醫(yī)學;2014年11期

8 路博聞;徐璐璐;張洋;韓光;;牙周組織工程研究進展:問題與應用[J];中國組織工程研究;2014年24期

9 黃旭;劉建華;王慧明;朱慧勇;李志勇;滕理送;;口內(nèi)入路下頜骨良性腫瘤切除同期自體骨移植修復重建術的臨床研究[J];中國修復重建外科雜志;2014年02期

10 杜鵑;范志朋;;利用干細胞及細胞因子再生牙周組織的研究進展[J];北京口腔醫(yī)學;2013年02期

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1 劉濤;絲素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷骨修復復合材料的制備與性能研究[D];浙江理工大學;2014年

2 劉淵聲;珍珠作為骨修復材料的應用基礎研究[D];清華大學;2014年

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1 葛倩倩;生物活性玻璃三維多孔支架的纖維沉積及性能研究[D];華南理工大學;2016年

2 靳思瑩;牙周GTR的生物學基礎與影響因素[D];上海交通大學;2015年

本文編號：2817337