傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡受限于光的衍射極限,其空間分辨率難以達(dá)到200 nm以內(nèi)。為了突破這一限制、提高光學(xué)顯微鏡的分辨率,科學(xué)家們發(fā)展了基于不同策略的超分辨率熒光顯微技術(shù),此技術(shù)的發(fā)展者也因此獲得了2014年度的諾貝爾化學(xué)獎。在眾多的超分辨率熒光顯微技術(shù)中,光學(xué)硬件系統(tǒng)、超分辨算法和生物樣本標(biāo)記是影響其時間、空間分辨率和成像質(zhì)量的三個主要因素。其中,生物樣本的標(biāo)記方法在過去的十年里獲得了長足發(fā)展。尤其是各種小分子熒光探針的開發(fā),使超分辨成像技術(shù)的分辨率得到了進(jìn)一步的提升。然而,現(xiàn)有的眾多商業(yè)化的熒光染料雖然光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異,但由于其本身的不透膜性而無法直接進(jìn)入活細(xì)胞,使其在活細(xì)胞超分辨成像領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了很大限制。為了解決以上問題,本文設(shè)計(jì)和合成了兩種分別用于標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)微絲和溶酶體的透膜有機(jī)熒光探針,它們具有“兩段式”相結(jié)合的結(jié)構(gòu)。另外,本文還將一種光學(xué)性質(zhì)極優(yōu)異的商業(yè)染料發(fā)展成為活細(xì)胞線粒體探針。主要研究內(nèi)容如下:(1)設(shè)計(jì)和合成了兩種分別用于標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)微絲和溶酶體的有機(jī)熒光探針,完整的探針結(jié)構(gòu)是由不透膜的商業(yè)化染料和無染料的肽段結(jié)合而成。其中,無染料的肽段包含了識別基團(tuán)和細(xì)胞穿膜肽,解決了特異性識別的問題和整體探針的透膜問題;而染料部分則可以選用帶有活性基團(tuán)的任何商業(yè)化染料,而不必考慮其透膜性。這種設(shè)計(jì)方式利用了商業(yè)染料優(yōu)異的超分辨性能,并用“兩段”相結(jié)合的方式增加染料選擇的靈活性,降低商業(yè)化染料帶來的成本。優(yōu)化確定了探針在活細(xì)胞內(nèi)的最佳孵育條件;并通過搭配使用不同顏色的商業(yè)化染料,將以上兩種探針成功應(yīng)用于不同種類的活細(xì)胞中,證明了探針的普適性。(2)研究了以上兩種探針分別在隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)超分辨成像和結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像系統(tǒng)中的成像效果。其中,在隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)超分辨成像實(shí)驗(yàn)中,利用活細(xì)胞微絲探針Actin-647獲得了10 s的時間分辨率和60 nm的空間分辨率;而在結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像中,利用活細(xì)胞溶酶體探針Lysosome-565表征了半胱氨酸組織蛋白酶在溶酶體內(nèi)部的不均勻分布,并記錄到了完整的溶酶體“融合-分裂”的過程。(3)基于商業(yè)化染料Atto 647N,本文發(fā)展了一種新的活細(xì)胞線粒體探針Mito-647N,具有現(xiàn)有線粒體探針中最佳的亮度和抗漂白能力。將本文新發(fā)展的線粒體探針Mito-647N和溶酶體探針Lysosome-565應(yīng)用于長時程雙色SIM超分辨成像中,首次發(fā)現(xiàn)了活細(xì)胞中溶酶體和線粒體的四種動態(tài)相互作用。以上幾種探針在超分辨成像中的成功應(yīng)用,特別是成像分辨率的提高和關(guān)于溶酶體和線粒體的新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),證明了將商業(yè)染料應(yīng)用于活細(xì)胞超分辨成像探針的重要意義。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318;O657.3
【部分圖文】：

圖 1.1 STED 顯微技術(shù)的成像原理[13]。Fig. 1.1 The principle of STED microscopy.SIM 采用寬場照明方式，在照明光中引入高空間頻率的圖案信息（三個方向，三個相位）與樣品信號疊加獲得低頻信息，由于引入的高頻信息已知，再通過計(jì)算

圖 1.2 通過結(jié)構(gòu)光照明提高分辨率[5]。Fig. 1.2 Resolution enhancement by structured illumination.PALM 和 STORM 顯微技術(shù)的原理非常類似。它們都是一次僅激活和激發(fā)視野中的一小部分分子，然后通過高斯擬合精確定位這些分子，再使用高光強(qiáng)的激光照射

圖 1.3 PALM 和 STORM 顯微技術(shù)的成像原理[13]。Fig. 1.3 The principle of PALM and STORM.從上述內(nèi)容可以看出，這三種策略各有優(yōu)缺點(diǎn)，適合于不同的情況，并無絕對

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本文編號：2811329