【摘要】：目的骨缺損是臨床上最常見(jiàn)的疾病之一,常由腫瘤、外傷、感染等疾病造成。大面積的骨缺損常常使用自體骨或者異體骨移植進(jìn)行治療。然而,受限于自體骨的有限來(lái)源和異體骨的吸收排斥反應(yīng)等,開(kāi)發(fā)更優(yōu)的人工骨支架材料成為迫切需要解決的問(wèn)題。在骨組織工程中,常常使用支架材料為細(xì)胞生長(zhǎng)提供3D環(huán)境,使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和生長(zhǎng)因子等作為成骨誘導(dǎo)補(bǔ)充劑進(jìn)行骨再生的優(yōu)化。但是大量使用生長(zhǎng)因子如骨形態(tài)蛋白等已經(jīng)被證實(shí)可能會(huì)帶來(lái)如異位成骨、脂肪液化等不良影響,因此探索一種非生長(zhǎng)因子類(lèi)的材料作為成骨補(bǔ)充劑具有重要意義。隨著人們對(duì)骨組織構(gòu)成和形成過(guò)程認(rèn)知的增加,基于膠原纖維的生物材料被廣泛應(yīng)用于骨組織工程中。骨組織是蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和膠原纖維等的混合物,由纖維內(nèi)礦化的膠原纖維作為物理組織結(jié)構(gòu)的第二層級(jí),為骨組織提供了物理應(yīng)力結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在骨基質(zhì)的研究中,通過(guò)使用多聚物誘導(dǎo)的液體樣前驅(qū)體(polymer-induced liquid-precursor)生成無(wú)定形磷酸鈣仿生礦化前驅(qū)體(amorphous calcium phosphate biomineralization precursors,ACP biomineralization precursors),能成功獲得膠原纖維內(nèi)礦化。在這個(gè)生物礦化的過(guò)程中,多聚物通過(guò)螯合飽和鈣磷溶液中的鈣離子和磷離子形成無(wú)定形磷酸鈣仿生礦化前驅(qū)體。這種無(wú)定形磷酸鈣仿生礦化前驅(qū)體通過(guò)粘附在膠原纖維上的特定位點(diǎn)滲透進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部,進(jìn)行結(jié)晶固化,最終形成沿著膠原纖維長(zhǎng)軸排列的羥基磷灰石礦物晶體。這種無(wú)定形磷酸鈣作為骨形成過(guò)程中的基本原料,除了具有促進(jìn)膠原纖維內(nèi)礦化的性能外,亦被證實(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和組織分化。因此,這種無(wú)定形磷酸鈣仿生礦化前驅(qū)體具有作為成骨補(bǔ)充劑的潛能。但是無(wú)定形磷酸鈣仿生礦化前驅(qū)體的液態(tài)樣特性限制了其原位礦化膠原纖維的局部使用,因此需要一種轉(zhuǎn)運(yùn)體系將其轉(zhuǎn)運(yùn)至特定部位以開(kāi)發(fā)更多臨床應(yīng)用潛能。介孔硅(mesoporous silica nanoparticle,MSN)具有較好的生物相容性和客體負(fù)載性能,已經(jīng)作為物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體系廣泛運(yùn)用于生物活性因子轉(zhuǎn)運(yùn),也為轉(zhuǎn)運(yùn)仿生礦化前驅(qū)體提供了思路。在本實(shí)驗(yàn)研究中,通過(guò)合成羧基化的大孔徑介孔硅,構(gòu)建仿生礦化前驅(qū)體轉(zhuǎn)運(yùn)體系,對(duì)所制備材料的理化性能、誘導(dǎo)膠原纖維內(nèi)礦化性能和機(jī)制以及體外成骨誘導(dǎo)性能進(jìn)行研究,探索其作為成骨補(bǔ)充劑的應(yīng)用潛能。方法實(shí)驗(yàn)主要概括為以下幾個(gè)內(nèi)容:一.以合成的傳統(tǒng)MCM-41型介孔硅為模板,利用擴(kuò)孔劑三甲苯(TMB)進(jìn)行孔徑擴(kuò)大,制備具有超大孔徑的單分散介孔硅體系。利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)氨基功能化在介孔硅表面接枝氨基功能基團(tuán),然后使用琥珀酸酐(succinic anhydride)開(kāi)環(huán)反應(yīng)在介孔硅表面接枝羧基基團(tuán)-COOH,獲得表面羧基功能化的大孔介孔硅(carboxylate-functionalized large pore mesoporous silica,CLMSN)。使用CLMSN負(fù)載聚丙烯胺鹽酸鹽(poly allylamine hydrochloride,PAH)介導(dǎo)的無(wú)定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate,ACP)PAH-ACP,獲得PAH-ACP@CLMSN。對(duì)合成步驟中所得的納米粒子LMSN、CLMSN、和PAH-ACP@CLMSN進(jìn)行物理化學(xué)表征分析,通過(guò)透射電鏡(transimission electron microscopy,TEM)、能量色散X射線廣譜檢測(cè)(energy dispersive x-ray spectroscopy,EDS)、X-射線粉末(powder X-Ray diffraction,XRD)、熱重分析(thermogravimetric analysis,TGA)、zeta電位測(cè)試、傅里葉紅外變換光譜分析(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、光電子能譜分析(X-ray photoelectron spectrograph,XPS)、氮?dú)馕矫摳綄?shí)驗(yàn)(nitrogen adsorption and desorption experiment)綜合驗(yàn)證表面羧基功能化及PAH-ACP的負(fù)載。二.通過(guò)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma optical emission spectroscopy,ICP-OES)測(cè)定納米粒子中Si、P、Ca粒子的釋放動(dòng)力學(xué)以獲得納米粒子中仿生礦化前驅(qū)體的釋放動(dòng)力學(xué),同時(shí)使用TEM對(duì)納米粒子的生物降解性能進(jìn)行檢測(cè)。使用納米粒子對(duì)2D膠原纖維進(jìn)行仿生礦化,探索PAH-ACP@CLMSN系統(tǒng)中仿生礦化前驅(qū)體釋放、粘附并進(jìn)入膠原纖維內(nèi)進(jìn)行晶核反應(yīng)獲得膠原纖維內(nèi)礦化的機(jī)制,并使用3D膠原海綿對(duì)PAH-ACP@CLMSN膠原纖維內(nèi)礦化能力進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。三.使用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(r BMSCs)和巨噬細(xì)胞系RAW264.7對(duì)不同濃度的LMSN和PAH-ACP@CLMSN進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)(CCK-8法)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PAH-ACP@CLMSN對(duì)r BMSCs細(xì)胞凋亡有無(wú)影響。通過(guò)檢測(cè)LMSN和PAH-ACP@CLMSN納米粒子對(duì)COL I、OPN、OCN、RUNX2基因、堿性磷酸酶活性、和細(xì)胞外鈣化結(jié)節(jié)沉積的影響,初步判斷其是否具有成骨誘導(dǎo)潛能。同時(shí)使用TEM、ICP-OES檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒子的吞噬作用。將FITC熒光顆粒整合至CLMSN中,對(duì)PAH-ACP@FITC-CLMSN粒子的攝取進(jìn)行免疫熒光分析,檢測(cè)納米粒子對(duì)r BMSCs細(xì)胞骨架的影響。結(jié)果一.在高溫高壓擴(kuò)孔劑反應(yīng)下,有效地獲得了介孔直徑約為14.88nm的大孔介孔硅納米顆粒;成功對(duì)介孔硅表面進(jìn)行了羧基功能化,這種羧基功能化不僅有利于PAH-ACP前驅(qū)體的負(fù)載,更為后續(xù)介孔硅在生物體系內(nèi)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)優(yōu)異的生物相容性打下基礎(chǔ)。PAH-ACP前驅(qū)體能有效負(fù)載于CLMSN中,這將有利于后續(xù)膠原纖維礦化及成骨的應(yīng)用。二.仿生礦化前驅(qū)體的釋放動(dòng)力學(xué)曲線證明CLMSN能在溶液中有效轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放仿生礦化前驅(qū)體PAH-ACP,其釋放的過(guò)程為10天內(nèi)的快速釋放和10-30天內(nèi)的緩慢釋放。PAH-ACP@CLMSN在膠原纖維外釋放的仿生礦化前驅(qū)體通過(guò)側(cè)向擴(kuò)散、粘附在膠原上特定位點(diǎn)后進(jìn)入膠原纖維內(nèi),進(jìn)一步通過(guò)晶體成核反應(yīng)進(jìn)行膠原纖維內(nèi)仿生礦化。這種仿生礦化轉(zhuǎn)運(yùn)體系對(duì)2D和3D膠原的纖維內(nèi)礦化均有效。PAH-ACP@CLMSN的降解從早期即開(kāi)始,大約60天后完成其降解,這種降解速率對(duì)于仿生礦化轉(zhuǎn)運(yùn)體系沒(méi)有不良影響。三.經(jīng)羧基化改性后的PAH-ACP@CLMSN對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均具有優(yōu)異的生物相容性,具有良好的生物學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)。巨噬細(xì)胞對(duì)PAH-ACP@CLMSN和LMSN的內(nèi)化作用不需要特別的介質(zhì)介導(dǎo),在與細(xì)胞接觸的早期即可產(chǎn)生內(nèi)化作用。巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒子的內(nèi)化作用未對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生不良影響。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)PAH-ACP@CLMSN和LMSN的內(nèi)化作用對(duì)細(xì)胞骨架細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞功能未產(chǎn)生不良影響。PAH-ACP@CLMSN相較于LMSN和未添加納米粒子的空白組而言,能有效增加ALP活性、促進(jìn)細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)的形成、促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá),具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化性能。結(jié)論綜上,PAH-ACP@CLMSN作為一種釋放PAH-ACP仿生礦化前驅(qū)體的大孔納米顆粒,兼具膠原纖維內(nèi)仿生礦化和促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的性能,具有作為成骨相關(guān)組織工程中的成骨誘導(dǎo)補(bǔ)充劑的潛能。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R68;R318.08
【圖文】：

29圖 1. 介孔硅 TEM 形貌觀察擴(kuò)孔前的介孔硅（bar=100 nm）；b.擴(kuò)大孔徑后的介孔硅 LMSN（bar=100 nm）；c.LM超薄切片（bar=100nm）；d.羧基功能化的大孔介孔硅 CLMSN（bar=50nm）。TEM images of LMSN before pore expansion (bar=100 nm); (b).TEM images of LMSN aftension (bar=100nm); (c) TEM images of epoxy resin-embedded, sectioned LMSN (bar= 100 n images of carboxyl functionalized large pore mesoporous silica (bar=50nm).

圖 2.介孔硅理化性能表征a. XRD 小角衍射（0-5°）未見(jiàn)明顯衍射峰；b. XRD 廣角衍射（0-5°）在 2θ =22°左右明顯衍射峰；c. N2 吸附與脫附曲線; d. 由 BET-BJH 法測(cè)得的孔徑分布圖。(a) Small-angle XRD profiles of LMSN; (b) Wide-angle XRD profile of LMSN, the broad band at 22° isindicative of non-crystalline scattering;(c) N2 adsorption desorption isotherms and (d) mesopore pore size distribution in LMSN, CLMSN andPAH ACP@CLMSN.

圖 3.PAH-ACP@CLMSN 納米顆粒 TEM 及 EDS 元素分布圖a.PAH-ACP@CLMSN 的 TEM 透射電鏡圖（左：PAH-ACP@CLMSN 的 TEM 大體形貌 bar=0.2μm；右：PAH-ACP@CLMSN 超薄切片 TEM 內(nèi)部形貌 bar=100 nm）；b.PAH-ACP@CLMSNEDS 元素分布圖（bar=100 nm）a. TEM of PAH-ACP@CLMSN (a. left, bar=0.2μm); TEM images of sectioned, epoxy resin-embeddedPAH-ACP@CLMSN (a. right, bar=100 nm); b. Elemental mapping of PAH-ACP@CLMSN

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本文編號(hào)：2803155