【摘要】：齲病、外傷、牙周病等均可能導(dǎo)致牙齒的缺損或缺失,牙齒自我修復(fù)缺損的能力非常有限,目前牙齒缺損修復(fù)方法雖然較多,但均存在著各種不足。組織工程技術(shù)利用干細(xì)胞多向分化潛能的特性,復(fù)合支架材料修復(fù)缺損組織和器官,是再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。課題組在前期的實(shí)驗(yàn)研究中成功制備出了機(jī)械強(qiáng)度高,孔隙率大小合適的三維聯(lián)通納米氧化鋯支架,可以作為組織缺損修復(fù)的支架材料。但是前期在支架制備的過程中發(fā)現(xiàn)支架首次燒結(jié)成型率有待提高。氧化鋯雖然具有良好的生物相容性和機(jī)械性能,但是其與細(xì)胞和組織親和力欠佳。RGD多肽是由3個氨基酸構(gòu)成的短肽,可以促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化。人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)是位于牙髓組織中的一種間充質(zhì)干細(xì)胞,在一定的誘導(dǎo)環(huán)境下具有多向分化能力,并具有來源廣泛、取材方便等優(yōu)點(diǎn)。hDPSCs的成牙本質(zhì)向分化是牙齒生長發(fā)育和牙髓組織損傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,其過程受多種生長因子和信號通路調(diào)控,具體機(jī)制尚未完全明了。LIM礦化蛋白-1(LMP-1)是一種具有成骨誘導(dǎo)活性的細(xì)胞內(nèi)非分泌蛋白,在礦化過程中起正向調(diào)節(jié)作用,大量研究表明LMP-1在生長發(fā)育和受外界刺激牙齒的牙髓組織、成牙本質(zhì)細(xì)胞及修復(fù)性牙本質(zhì)中有著不同程度的表達(dá),但是其在hDPSCs成牙本質(zhì)方向分化過程中的作用和機(jī)制目前尚無相關(guān)的報道。本研究旨在通過改進(jìn)氧化鋯支架燒結(jié)工藝,表面修飾改性,進(jìn)一步完善支架的載體性能。探討LMP-1在hDPSCs成牙本質(zhì)方向分化過程中的作用,為hDPSCs成牙本質(zhì)方向分化提供新的思路和方法,初步觀察復(fù)合RGD多肽的氧化鋯支架對LMP-1過表達(dá)hDPSCs黏附、增殖和分化的影響,探討其對牙齒缺損修復(fù)及應(yīng)用到組織工程的可行性。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:1、三維聯(lián)通納米氧化鋯支架性能優(yōu)化本研究通過延長支架燒結(jié)過程中1360℃到1060℃冷卻時間,發(fā)現(xiàn)隨著冷卻時間的不斷延長,支架燒結(jié)成型率明顯提高。且SEM觀察隨著冷卻時間的延長,支架梁柱上的裂紋數(shù)量和長度明顯減少;通過對支架進(jìn)行Micro-CT掃描重建和壓縮強(qiáng)度測試,發(fā)現(xiàn)冷卻時間超過8h后,支架的平均小梁數(shù)目和小梁平均厚度以及壓縮強(qiáng)度顯著高于其他組。通過FTIR分析RGD多肽能夠通過共價鍵良好固定在支架表面,CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)通過RGD修飾能促進(jìn)細(xì)胞在支架上的初期黏附。2、hDPSCs的分離、純化、培養(yǎng)與鑒定本實(shí)驗(yàn)通過組織塊結(jié)合酶消化法從人牙髓組織中分離培養(yǎng)出原代細(xì)胞,再經(jīng)有限稀釋法挑選單克隆進(jìn)行細(xì)胞純化和傳代擴(kuò)大培養(yǎng),通過克隆形成能力檢測細(xì)胞具有較強(qiáng)克隆集落形成能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物,陰性表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)記物;經(jīng)成骨/成牙本質(zhì)方向誘導(dǎo)分化和成脂方向誘導(dǎo)分化后染色均呈陽性。證明成功分離培養(yǎng)出了hDPSCs。3、LMP-1對hDPSCs增殖和分化能力的影響本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,能夠高效感染hDPSCs,穩(wěn)定沉默和過表達(dá)hDPSCs中LMP-1,通過CCK-8檢測細(xì)胞的增殖能力,發(fā)現(xiàn)LMP-1基因沉默和過表達(dá)對hDPSCs的增殖能力無明顯影響;沉默hDPSCs中LMP-1表達(dá),細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成能力明顯減弱,通過qRT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)ALP、DSPP、DMP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)也不同程度降低;而過表達(dá)LMP-1后,細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成能力增強(qiáng),ALP、DSPP、DMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)也顯著增加。4、三維聯(lián)通納米氧化鋯支架附著LMP-1過表達(dá)hDPSCs的體外研究本研究將前期性能優(yōu)化的支架作為載體,附著LMP-1過表達(dá)的hDPSCs培養(yǎng),觀察細(xì)胞能夠在支架上良好的黏附和增殖;通過CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100mg/L的RGD多肽能更好的促進(jìn)細(xì)胞在氧化鋯支架上的黏附和增殖。通過ALP活性檢測,觀察到復(fù)合RGD多肽的納米氧化鋯支架對LMP-1過表達(dá)hDPSCs的成骨/成牙本質(zhì)方向分化有協(xié)同作用。綜上所述,本研究通過改進(jìn)支架燒結(jié)流程,延長冷卻時間,明顯改善了支架燒結(jié)的首次成型率,且提高了支架強(qiáng)度;使用RGD多肽修飾支架后增加了支架的親水性,提高了支架的細(xì)胞初期黏附能力;成功分離鑒定培養(yǎng)出了hDPSCs,沉默或過表達(dá)hDPSCs中LMP-1的表達(dá),對細(xì)胞增殖能力無明顯影響,LMP-1沉默可抑制hDPSCs的成牙本質(zhì)方向分化,而過表達(dá)LMP-1可促進(jìn)hDPSCs的成牙本質(zhì)方向分化;100mg/L的RGD多肽修飾的支架能促進(jìn)LMP-1過表達(dá)hDPSCs的黏附、增殖和分化,為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提供了有效基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R783.1
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文孔三維聯(lián)通空間結(jié)構(gòu)。在對照組（冷卻時間 1h）中，燒結(jié)出的支架周圍均可見落的氧化鋯支架顆粒，時有支架整體結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斷裂、坍塌等情況；隨著時間的不斷延長，支架周圍脫落顆粒明顯減少，在冷卻時間≥8h 組均未見明顯脫顆粒，且各實(shí)驗(yàn)組中均未見到支架整體結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象（圖 1.1）。

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文孔三維聯(lián)通空間結(jié)構(gòu)。在對照組（冷卻時間 1h）中，燒結(jié)出的支架周圍均可見落的氧化鋯支架顆粒，時有支架整體結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斷裂、坍塌等情況；隨著時間的不斷延長，支架周圍脫落顆粒明顯減少，在冷卻時間≥8h 組均未見明顯脫顆粒，且各實(shí)驗(yàn)組中均未見到支架整體結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象（圖 1.1）。

-24-圖 1.2 不同冷卻時間納米氧化鋯支架 SEM 觀察.3 納米氧化鋯支架 Micro-CT 掃描通過對支架進(jìn)行 Micro-CT 掃描重建，我們可以清楚看到支架之間具有良好隙結(jié)構(gòu)，支架孔隙率高，孔徑大小在 600-800μm 之間（圖 1.3A）。Micro-CT 分析顯示冷卻時間≥8h 的實(shí)驗(yàn)組平均小梁數(shù)量顯著高于對照組（5），組間無明顯差異（p＞0.05）（圖 1.3B）；小梁平均厚度分析顯示：冷卻 6h 組以及≥8h 組的小梁平均厚度都明顯高于對照組（分別為 p＜0.05，p＜0卻時間 4h 和 6h 組之間，8h、10h、12h 組間無明顯差異（p＞0.05）（圖 1.

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本文編號：2791054