【摘要】：周圍神經(jīng)損傷是世界范圍內致殘的主要疾病之一。因損傷導致的神經(jīng)缺損治療手段有限,現(xiàn)有的方法主要是自體神經(jīng)移植。但該方法存在供區(qū)神經(jīng)功能受損、可移植神經(jīng)來源有限等缺點,療效也不夠理想。學者們在不斷尋找能夠補充甚至替代自體神經(jīng)移植的方法。采用人工合成的神經(jīng)導管修復神經(jīng)缺損是最初的一種嘗試。2000年前后共11種商品化導管在美國進入臨床,但因修復效果欠佳而未得到廣泛應用。目前提高修復效果的方法集中在改善導管內的再生微環(huán)境,即結合材料學和工程學,制出能提供營養(yǎng)因子和/或細胞支持的組織工程神經(jīng)(Tissue-engineered nerve grafts,TENGs)。理論上,含細胞的TENGs療效優(yōu)于僅含藥物的TENGs;但因細胞移植短期內難以進入臨床且不適用于急性損傷中的神經(jīng)修復,載藥類TENGs更具臨床應用價值。近三十年來,諸多載有營養(yǎng)因子的TENGs被研制出來。由于這些因子生物半衰期極短,減緩其釋放以延長體內作用時間成為技術重點。已有的方法是將營養(yǎng)因子通過各種理化方法連接于管壁或管內支架,如與導管材料混合、浸透、吸附、交聯(lián)、涂層、微球包埋、添加至納米纖維支架中等等。應用上述技術均能構建出具有藥物緩釋功能的TENGs,修復效果也顯著優(yōu)于未載藥導管。但這些方法均停留在實驗階段。在已有商品化導管獲批進入臨床的有利基礎上,載藥導管的臨床轉化之路卻并不如預期之快。眾多取得良好動物實驗結果的文獻均未見后續(xù)的轉化研究,亦無臨床試驗的注冊。大量的實驗報道與匱乏的轉化成果之間的不平衡促使我們以轉化醫(yī)學的視角重新審視目前已有的設計思路,評估設計方案本身是否存在可能阻礙技術商品化和臨床轉化的因素�，F(xiàn)有方法中,藥物在制備導管時即需被溶解,與管壁材料或管內支架發(fā)生復雜的連接反應,再經(jīng)干燥后備用。如進行工業(yè)化生產(chǎn),在這一系列的操作中以及后續(xù)產(chǎn)品的貯存中,保持這些易降解蛋白質類藥物的活性是一個挑戰(zhàn)。此外,不同藥物可能需要不同的連接載體,因此一種導管設計缺乏擔載不同藥物的靈活性。最后,能夠應用于神經(jīng)導管的材料本身就需滿足許多嚴格的生物力學與生物相容性要求,進一步附于其新的載藥功能使導管的制備工藝更復雜,生產(chǎn)成本更昂貴。這些依賴于導管結構材料的緩釋方式都具有上述不利于規(guī)�；a(chǎn)與商品化的因素。因此,為避免這些因素從而加快載藥TENGs的臨床轉化,我們試圖尋求一種不依賴于導管材料的藥物加載與緩釋方式,無需導管修飾和交聯(lián)劑等連接介質,即構建出擁有獨立藥物緩釋系統(tǒng)的TENGs。溫敏型水凝膠是一種能滿足上述要求的極具應用前景的候選材料。這種材料室溫下呈液態(tài),易與藥物混合,注射至體內后在體溫作用下轉變?yōu)槟z態(tài)成為藥物的擔載體。如應用于載藥TENGs,藥物的擔載則可避開復雜的藥物連接反應,在術中現(xiàn)用現(xiàn)溶解。目前尚未見將其作為載藥系統(tǒng)應用于TENGs的實驗研究。因此本研究構建了一種新型的TENG:神經(jīng)缺損用殼聚糖導管連接后,向導管內注入與神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)混合的溫敏型水凝膠溶液,在體溫作用下形成凝膠,成為一種具有藥物緩釋功能的導管內填充物。本研究采用的水凝膠為聚氨基酸類的兩親性嵌段聚合物:聚乙二醇單甲醚-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯),mPEG-PELG。本研究包括以下幾個方面:一.mPEG-PELG水凝膠的制備與檢測1.制備由乙醇和L-谷氨酸經(jīng)酯化反應生成γ-乙基-L-谷氨酸酯(ELG);ELG經(jīng)三光氣作用形成γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐(ELG-NCA);ELG-NCA以端氨基聚乙二醇單甲醚(mPEG-NH_2)為大分子引發(fā)劑發(fā)生開環(huán)聚合反應生成mPEG-PELG。所測得的核磁共振氫譜(~1H-NMR)上各信號峰均能夠準確歸屬,表明成功制備了目標聚合物。2.微觀結構檢測利用紅外光譜、熒光光譜法和透射電子顯微鏡檢測聚合物,發(fā)現(xiàn)其二級結構中以β折疊為主且能出現(xiàn)膠束化行為,具有發(fā)生凝膠轉變的微觀結構基礎。3.溶膠-凝膠轉變采用試管倒置法和流變儀檢測聚合物的凝膠轉變行為。mPEG-PELG溶液均可隨溫度升高而發(fā)生凝膠轉變,且隨著濃度升高,發(fā)生轉變的溫度逐漸下降�；煊蠳GF的8.0 wt%的聚合物可在體溫附近發(fā)生凝膠轉變,被選作體內實驗的聚合物濃度。4.體外降解與細胞毒性與在Tris-HCl緩沖溶液中相比,水凝膠在含彈性蛋白酶或蛋白酶K的Tris-HCl緩沖溶液中降解加快,但仍持續(xù)存在26天以上。對大鼠施旺細胞系RSC96細胞進行MTT實驗未見聚合物具有細胞毒性。二.mPEG-PELG擔載NGF的體外釋放實驗1.擔載NGF的劑量優(yōu)化及體外釋放曲線配置NGF濃度為0.5、1.0和1.5 ng/μL的水凝膠,測試緩釋曲線。根據(jù)NGF在1~10 ng/mL時對軸突生長促進作用最佳,選擇1.0 ng/μL的劑量。第1天釋放濃度為13.87 ng/mL,第2天降至10 ng/mL以下,隨后每日緩釋濃度平穩(wěn)在1.5 ng/mL左右,持續(xù)28天。2.緩釋NGF的生物活性載有NGF的mPEG-PELG水凝膠的緩釋上清能誘導大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC12細胞分化,隨后對PC12細胞進行Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NGF下游的MAPK/ERK通路被激活。表明釋放出的NGF有生物學活性。三.基于mPEG-PELG構建的擔載NGF組織工程神經(jīng)的體內實驗1.TENG構建與實驗分組將mPEG-PELG作為可注射性的藥物載體構建TENG:神經(jīng)缺損用殼聚糖導管連接后,向導管內注入混有NGF的mPEG-PELG溶液,10 min后形成凝膠成為一種載藥的管內填充物。為評估療效,制備大鼠坐骨神經(jīng)10 mm缺損模型并進行如下分組:Scaffold組:缺損由導管連接;Scaffold+mPEG-PELG組:導管內注射不含NGF的mPEG-PELG;Scaffold+NGF/IM組:缺損由導管連接后,每日接受2.0μg/kg NGF肌注;Scaffold+NGF/mPEG-PELG組:新型載藥TENG組;Autograft組:自體神經(jīng)移植。2.再生神經(jīng)纖維的組織形態(tài)學術后14天取術側神經(jīng)進行縱切或橫切,免疫熒光標記神經(jīng)絲蛋白(NF200),縱切片上測得Scaffold+NGF/mPEG-PELG組再生神經(jīng)纖維長度為7231.67±216.94μm,較Scaffold組,Scaffold+mPEG-PELG組,Scaffold+NGF/IM組顯著增加,與Autograft組(8123.34±262.32μm)無統(tǒng)計學差異。橫切片上計數(shù)再生神經(jīng)纖維數(shù)量,組間比較呈現(xiàn)類似的結果。術后3個月在距導管遠端3 mm處橫切,標記NF200和S100β(施旺細胞標志物),觀察遠端吻合口的神經(jīng)再生。Scaffold+NGF/mPEG-PELG組和Autograft組軸突數(shù)量和S100β染色陽性的神經(jīng)纖維數(shù)量均顯著多于其他三組。3.再生神經(jīng)纖維髓鞘形成情況術后3個月在距導管遠端3 mm處進行橫切,電鏡下測量髓鞘層數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維的直徑、密度以及百分比。在這五個指標上,Scaffold+NGF/mPEG-PELG組與Autograft組效果相近,均顯著高于其他三組。4.電生理功能術后3個月時,Scaffold+NGF/mPEG-PELG組和Autograft組復合肌肉動作電位的波幅大于其他三組,運動神經(jīng)傳導速度快于其他三組,均具有統(tǒng)計學差異。5.終末靶器官與運動功能術后21天時各組的腓腸肌和脛骨前肌均出現(xiàn)明顯萎縮且運動終板的失神經(jīng)支配現(xiàn)象明顯,組間無明顯差異。術后6個月時各組均有所改善。Scaffold+NGF/mPEG-PELG組實驗側/正常側的肌肉濕重比恢復至腓腸肌0.54±0.02,脛骨前肌0.85±0.03,出現(xiàn)神經(jīng)支配的運動終板比例為31.67±3.28%,3項數(shù)據(jù)的比較均顯著優(yōu)于Scaffold組、Scaffold+mPEG-PELG組和Scaffold+NGF/IM組,與自體神經(jīng)移植組接近。術后9個月行足跡分析,Scaffold+NGF/mPEG-PELG組和Autograft組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(-32.67±3.58、-28.84±4.16)顯著高于Scaffold組(-64.84±6.16)、Scaffold+mPEG-PELG組(-62.07±5.58)、和Scaffold+NGF/IM組(-51.67±4.20)。結論:本研究作為前期基礎研究,為構建利于規(guī)�；a(chǎn)、具有臨床轉化潛力、且操作簡便應用靈活的載藥TENGs提供了新的思路。mPEG-PELG溫敏型水凝膠可作為NGF的緩釋載體有效延長其釋放周期;應用mPEG-PELG構建的TENG在橋接大鼠坐骨神經(jīng)10 mm缺損中取得了良好的修復效果,再生神經(jīng)的形態(tài)學與功能學恢復接近自體神經(jīng)移植。其構建方式具有轉化優(yōu)勢:藥物緩釋系統(tǒng)與導管材料的分離簡化了制造工藝,無需修飾導管,無需復雜的藥物連接反應,藥物可現(xiàn)用現(xiàn)溶解避免藥效損失;溫敏型水凝膠的可注射性便于操作;可靈活更換擔載藥物�；跍孛粜退z構建的載藥TENGs有潛力成為商品化產(chǎn)品,有助于填補臨床上對有效修復神經(jīng)缺損且無副損傷方法的需求。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R688;R318.08
【圖文】：

每年用于周圍神經(jīng)修復的產(chǎn)品市場價值約為 15 億美元，而全球周經(jīng)損傷的治療產(chǎn)品市場價值更是高達 35 億美元，并以每年 11%的速度增長在科研領域，對人工神經(jīng)移植物的研究投入同樣在加大，全力尋找進提高人工導管療效的方法（圖 1.1）[10]。最初的研究方向是對導管結構進行改研究人員認為療效欠佳的一個重要原因是，這類產(chǎn)品完全中空的結構沒有給再生神經(jīng)提供足夠的物理支持，因此嘗試研制了各種管內的纖維狀、柱填充支架，期望有助于施旺細胞的排列遷移與再生軸突的生長延伸。與中結構相比，在實驗中表現(xiàn)出一些優(yōu)勢[10,16]。而目前的研究方向則更多地集為再生神經(jīng)提供營養(yǎng)因子支持或細胞支持，通過改善損傷局部微環(huán)境以利經(jīng)再生，即結合材料科學和組織工程學，制備出能夠提供神經(jīng)營養(yǎng)因子和（細胞支持的組織工程神經(jīng)（Tissue-engineered nerve grafts，TENGs）[11,12,17-19且已經(jīng)在動物實驗中取得了鼓舞人心的治療效果[20-26]，成為目前修復神經(jīng)缺最具吸引力的研究領域。

圖 1.2 應用直接浸透法構建梯度載藥神經(jīng)導管[57].1.2 與管壁材料交聯(lián)法在該方法中，管壁材料通過與欲擔載藥物發(fā)生化學交聯(lián)反應而產(chǎn)生4,42,58-63]。不同于上述直接浸透法，交聯(lián)法需要靠交聯(lián)劑作為中間橋梁將藥物間接相連。體外實驗在評估神經(jīng)導管通過交聯(lián)法擔載藥物的緩釋情況時，發(fā)現(xiàn)藥放周期可以達到一個月甚至兩個月，而浸透法的釋放時長多為數(shù)天或數(shù)項體外研究中用碳化二亞胺（carbodiimide）作為交聯(lián)劑，將 NGF 加載-磷酸三鈣膜（GTG）上[62]。如圖 1.3 所示，carbodiimide 一側可與 NGF 共價結合，另一側與 GTG 膜表面的羧基共價結合。

圖 1.2 應用直接浸透法構建梯度載藥神經(jīng)導管[57].1.2 與管壁材料交聯(lián)法在該方法中，管壁材料通過與欲擔載藥物發(fā)生化學交聯(lián)反應而產(chǎn)生4,42,58-63]。不同于上述直接浸透法，交聯(lián)法需要靠交聯(lián)劑作為中間橋梁將物間接相連。體外實驗在評估神經(jīng)導管通過交聯(lián)法擔載藥物的緩釋情況時，發(fā)現(xiàn)藥周期可以達到一個月甚至兩個月，而浸透法的釋放時長多為數(shù)天或數(shù)體外研究中用碳化二亞胺（carbodiimide）作為交聯(lián)劑，將 NGF 加載磷酸三鈣膜（GTG）上[62]。如圖 1.3 所示，carbodiimide 一側可與 NGF 價結合，另一側與 GTG 膜表面的羧基共價結合。

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本文編號：2770095