【摘要】：當人體自身的組織、器官因外傷或者疾病而產(chǎn)生損傷和功能性喪失時,會對人類的健康及生命安全產(chǎn)生嚴重的威脅。病變組織和器官的及時修復以及功能恢復則成為治療疾病的重要環(huán)節(jié)。在現(xiàn)有的醫(yī)學認知條件下,根據(jù)病變部位的損傷程度對受損部位進行修補,或者借助自體、異體移植以及人工器官對其進行置換和重建,或許是最好的解決辦法。然而,目前仍有許多重大科學問題亟待解決,這些問題可以歸納為以下兩方面。其一,自愿捐獻的供體器官數(shù)量明顯不足,難以滿足臨床需求;其二,通過人工手段開發(fā)的人工組織、器官與人體組織的同源性差、結構差異大,很難兼具良好的生物相容性和機械性能。因此,最大限度地提高人工生物材料的生物相容性并縮短生物材料的開發(fā)周期,是提高人工組織、器官臨床應用成功的必要環(huán)節(jié)和重要保障。目前,對生物材料的生物相容性評價多采用體外評價和體內(nèi)評價。體外評價以通過體外建立的細胞學實驗為基礎,對材料與細胞或血液的相容性進行評價;體內(nèi)評價是直接將材料植入實驗動物體內(nèi)對材料與組織是否相容進行評價。相較于動物體內(nèi)實驗,體外評價更為方便、快捷,可以節(jié)約大量的時間、金錢和人力,已廣泛用于紡織生物材料的設計及性能預估。但是,目前的體外評價手段具有一定的局限性。首先,定性分析需要通過定量分析來佐證;其次,這兩種方法均存在一個致命的缺陷,即難以揭示細胞生長的內(nèi)在因素及調(diào)控機制。因此,在體外評價體系中,引入一個既能反映細胞生長狀態(tài),又能揭示影響細胞生長的機制的合適的指標和合理的方法,具有重要意義。針對目前生物相容性體外評價所存在的缺陷,本課題以纖維集合體微納結構對細胞黏附的影響為切入點,圍繞以下四個方面進行研究。(1)引入細胞間粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecular-1,ICAM-1)作為評價指標,揭示材料結構與細胞黏附之間的調(diào)控機制。通過選用不同孔徑的篩網(wǎng)以控制發(fā)泡劑的尺寸,制備孔徑分布為0-38μm、38-75μm、75-100μm的PCL多孔膜,測定其水接觸角,評價不同孔徑分布對材料親疏水性的影響。隨之,將材料與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)進行共同培養(yǎng),分別使用免疫熒光、免疫酶標技術(ELISA)檢測孔徑大小及其分布是否影響細胞膜表面胞間粘附分子(Membrane ICAM-1,mICAM-1)、可溶性粘附分子(SolubleICAM-1,sICAM-1)的表達,分析不同孔徑分布的材料表面,細胞表達mICAM-1與sICAM-1之間的關系,探究其作為新的指標評價細胞在材料表面黏附狀態(tài)的可行性、可靠性及準確性。(2)通過均質(zhì)微孔機織平紋結構的構建,深入研究不同微米級孔徑結構與細胞生長特性的構效關系并選擇最優(yōu)結構。選取30 D滌綸單絲和復絲作為基礎材料,選取30 D滌綸單絲為經(jīng)紗,控制經(jīng)紗密度為850根/10厘米不變,選用30 D的滌綸單絲或復絲作為緯紗并改變緯紗密度(單絲600、700和800根/10厘米,復絲500、600和700根/10厘米),織造具有不同微米級孔徑尺寸的滌綸平紋機織結構;表征材料表面的孔隙率、緊度和親疏水性;通過CCK-8、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、ICAM-1表達評價其對細胞細胞生長特性的影響,優(yōu)選最適宜細胞黏附和增殖的機織結構及相應的微米級孔徑。(3)探究機織結構由低溫等離子刻蝕處理形成表面具有納米溝槽的拓撲結構,研究其表面納米結構變化對細胞糖組的影響。選用氬氣,在20 Pa的真空度下處理5min,改變刻蝕功率(150 W、200 W、250 W和300 W),對滌綸平紋織物進行低溫等離子體刻蝕,在單絲表面構建了四種不同的納米級溝槽結構。使用CCK-8、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡,檢測黏附在材料表面的細胞活性和生長狀態(tài),免疫熒光、ELISA法檢測細胞mICAM-1及sICAM-1的表達水平,評價機織結構表面的納米級拓撲結構對細胞相容性的影響;并將最新的細胞O-糖鏈擴增技術(Cellular O-Glycome Reporter/Amplification,CORA)、蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)、膠內(nèi)酶解以及質(zhì)譜分析引入生物材料的細胞相容性評價體系,通過材料微納結構對N-聚糖和O-聚糖表達的影響,即細胞糖組變化揭示其對細胞生長的調(diào)控機制。(4)初步探索在不同流速下,內(nèi)皮細胞在不同微納結構表面的黏附力強弱,以及在動態(tài)培養(yǎng)條件下細胞在材料表面黏附力與流體剪切力之間的關系。利用體外循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng),通過控制體系內(nèi)流體的流速(1 m/s,2 m/s和3 m/s),檢測并分析流體對材料表面黏附細胞進行沖刷后,單位面積材料表面剩余黏附細胞與流體剪切力的關系。實驗結果表明:(1)在一定范圍內(nèi)(0-100 μm),PCL多孔膜表面親水性隨孔徑增大而提高。同時,隨多孔膜表面孔徑增大,I型膠原在材料表面的單位面積黏附量也相應增加;孔徑分布不但影響材料表面的親疏水性,也影響細胞外基質(zhì)在材料表面的黏附以及細胞在材料表面的黏附和增殖。人臍靜脈內(nèi)皮細胞在微孔直徑為0-38 μm的PCL膜表面生長7天可形成單細胞內(nèi)皮層,在直徑為38-75 μm的PCL膜表面細胞覆蓋面積為60%,在直徑75-100 μm的PCL膜表面細胞覆蓋面積為80%。ICAM-I表達水平,可以作為評價細胞與材料黏附及材料生物相容性的一個重要指標;mICAM-1升高細胞在材料表面的黏附及增殖能力較強;sICAM-1升高細胞在材料表面的黏附及增殖能力受抑。(2)控制經(jīng)紗種類為單絲并保持經(jīng)紗密度不變,僅改變緯紗密度及選用單絲或復絲作為緯紗,成功構建了六種具有不同孔隙率和緊度的機織平紋結構,其水接觸角均在30°-45°以內(nèi),化學結構無明顯差異。當緯紗為單絲時,隨緯紗密度增加,親水性提高;當緯紗為復絲時,隨緯紗密度增加,親水性減弱;細胞在緯紗為復絲的表面黏附情況優(yōu)于單絲,這是因為復絲表面存在天然的平行溝槽結構,且組織點處的復絲表面較為平整,細胞可以附著的位點較多。細胞在機織微孔材料表面的初始黏附多集中在組織點處,組織點處孔徑尺寸越小,mICAM-1水平越高,sICAM-1濃度越低。設計密度為經(jīng)密(單紗)×緯密(復絲)為850×700根/10厘米的結構,其孔徑尺寸小于20 μm時有助于細胞在材料表面內(nèi)皮化進程,確定為本實驗最優(yōu)結構。(3)選用氬氣等離子體對優(yōu)選后的機織滌綸平紋材料(A:850×700根/10厘米)進行刻蝕,經(jīng)過等離子體刻蝕后,在材料C(200 W)、D(250 W)和E(300 W)表面均出現(xiàn)了相對明顯的溝槽結構,溝槽寬度分別為 294.20 ± 0.08 nm、523.63 ± 0.14 nm 和 785.07 ± 0.21 nm,而在材料B表面的單絲上,僅發(fā)現(xiàn)少量不規(guī)則的細紋,說明溝槽的存在對于該種O-聚糖結構的表達起到了一定的促進作用。與未處理前相比,具有微納溝槽結構的材料表面細胞sICAM-1的水平明顯降低,有助于細胞黏附。與空白對照相比,未經(jīng)等離子體處理的材料表面細胞 Core1(955、1003Da)、Core2(1317、1404、1766Da)結構的表達均有降低,N-聚糖結構未見明顯改變。等離子體處理不能影響材料表面細胞N-聚糖表達,但可不同程度地影響材料表面細胞O-聚糖表達;B表面的細紋結構只能升高細胞Core1(1003 Da)及Core2(1404Da)結構表達水平;具有微納溝槽結構表面的C、D和E材料可使Core 1及Core 2結構增高。(4)體外動態(tài)培養(yǎng)實驗結果表明,等離子體刻蝕構建的微納溝槽結構可增強細胞在材料表面的黏附力。當材料用于制作人工血管時,可根據(jù)血管壁所受剪切力,依據(jù)不同剪切力作用下,材料表面剩余黏附細胞數(shù)量來選擇合適的材料。根據(jù)不同等離子體刻蝕功率將實驗材料編號為 A(150W)、B(200W)、C(250W)、D(300W)和 E(未處理試樣),當剪切力5.4dyn(體外培養(yǎng)流速為1m/s)部位的選材順序為DB=CA=E,剪切力為7.0dyn(體外培養(yǎng)流速為2m/s)部位的選材順序為DAC=BE,而剪切力為11.2dyn(體外培養(yǎng)流速為3m/s)部位的選材順序為D=ABC=E。綜上所述,本研究通過構建具有不同微納拓撲結構的機織平紋表面,不僅證實了微納拓撲結構可影響細胞黏附,而且成功地將粘附分子引入材料生物相容性的評價體系;并首次通過探究材料結構對黏附細胞表面糖組結構表達的影響,揭示了材料影響內(nèi)皮細胞黏附的根本原因。在此基礎上,借助體外動態(tài)培養(yǎng),探究了不同流體剪切力對材料表面黏附細胞的影響,進一步完善了體外生物相容性評價體系,為材料的結構設計及生物相容性評價奠定了堅實的基礎。
【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08
【圖文】：

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本文編號：2764516