【摘要】：研究目的:(1)改進現(xiàn)有生物3D打印流程和生物材料,提高3D打印效率和打印質(zhì)量;(2)探究Alg-Gel生物墨水溶劑PBS的離子強度(或濃度)對生物墨水可打性和打印組織形態(tài)保持能力的影響;(3)探究Alg-Gel生物墨水溶劑PBS的離子強度(或濃度)對表皮干細胞生物學(xué)行為的影響;(4)探究雙向調(diào)節(jié)Alg-Gel生物墨水溶劑PBS的離子強度和溶質(zhì)明膠的濃度對表皮干細胞的干性維持和分化的作用。研究方法:(1)通過檢測不同海藻酸鈉原料樣品的分子量分布,選擇分子量均一、雜質(zhì)含量較少的樣品;通過檢測運用不同打印溫度和打印噴頭進行打印后的組織中表皮干細胞的細胞活性,選擇對細胞活性影響較小的打印溫度和噴頭。(2)檢測不同溶劑的Alg-Gel生物墨水的黏度、剪切應(yīng)力、儲能模量以及耗能模量曲線,對生物墨水進行可打性測試,并分析物理性能與可打性的相互關(guān)系;對不同溶劑Alg-Gel生物墨水的打印組織進行體外培養(yǎng),觀察其表面形態(tài)并觀測其形態(tài)保持能力,并分析其與生物墨水機械性能的相互關(guān)系。(3)運用Live/Dead染色檢測不同溶劑的Alg-Gel生物墨水打印組織中表皮干細胞在體外培養(yǎng)中活細胞比例的變化;運用Ki-67染色檢測表皮干細胞增殖活性的變化;運用免疫熒光染色法和RT-PCR檢測表皮干細胞表達角質(zhì)蛋白K5、K14、K8和K18的情況,分析其向汗腺細胞分化的情況:顯微鏡下觀察對打印微結(jié)構(gòu)內(nèi)細胞聚集情況進行評估和分析。(4)運用改進后的3D打印流程測試不同溶劑離子強度和溶質(zhì)濃度的Alg-Gel生物墨水的可打性,并測量不同打印組織的延展率;運用Live/Dead染色檢測生物墨水中活細胞比例在體外培養(yǎng)過程中的變化;運用RT-PCR對不同生物墨水中表皮干細胞表達K5、K14、K8、K18、K10和E-cad的情況進行定量分析;運用顯微鏡對打印微結(jié)構(gòu)中細胞聚集情況進行評估,并結(jié)合細胞表達marker的情況對細胞增殖和分化的情況進行分析。研究結(jié)果:(1)海藻酸鈉樣品C的分子量分布較集中,且實際打印組織中雜質(zhì)較少;內(nèi)徑≥340 μm的打印噴頭對細胞剪切應(yīng)力較小,且對打印后細胞活性影響較小,內(nèi)徑340 μm的打印噴頭對細胞剪切應(yīng)力明顯增大,且顯著降低了打印后的細胞活性;打印筒溫度為4℃時,活細胞比例低于50%;打印筒溫度升至10℃-20℃之間時,活細胞比例明顯增加;打印筒溫度升至20℃以上時,活細胞比例基本維持在90%以上。打印平臺溫度對細胞活性影響比打印筒小,相同打印筒溫度下,不同平臺溫度下細胞活性不變。(2)從生物墨水B-1到B-4,隨溶劑離子強度的增加,Alg-Gel生物墨水的儲能模量(G')明顯增加,耗能模量(G")明顯減小;同時,黏度(V)明顯減小,剪切應(yīng)力也隨之減小;B-1的表面平坦,表面細胞伸展;B-2的表面呈現(xiàn)光滑的溝壑狀,細胞伸展和分支明顯;B-3和B-4表面明顯變得疏松且呈顆粒狀,表面的細胞不伸展或聚集成細胞團且表面被墨水包裹;在體外培養(yǎng)過程中,B-1和B-2打印組織基本保持了打印形態(tài),透光性好,打印組織中的細胞清晰可見,而B-3和B-4打印組織明顯膨脹,B-4膨脹更嚴重,鏡下觀察時打印組織表面呈絨毛狀,透光性差,細胞影模糊,并出現(xiàn)了打印材料聚集和散落的現(xiàn)象。(3)3D打印的打印過程對細胞活性的影響較小,但隨著體外培養(yǎng)時間的延長,細胞活性緩慢下降;體外培養(yǎng)過程中,細胞增殖活性下降明顯,B-1增殖活性降至50%以下,B-2下降趨勢較緩;B-2打印組織中細胞增殖并聚集成團現(xiàn)象比較明顯,且在第14-28天之間,細胞團內(nèi)細胞影逐漸模糊,部分形成了不規(guī)則扭曲的腺樣結(jié)構(gòu);B-2打印組織中,細胞持續(xù)表達K5、K14的同時,K8和K18的表達也明顯升高。(4)同時改變Alg-Gel生物墨水的溶質(zhì)明膠濃度和溶劑PBS離子強度,明顯影響了可打性:低濃度明膠+中、高離子強度生物墨水無法完成打印,低濃度明膠+低離子強度以及中濃度明膠+高離子強度生物墨水打印組織的延展率較高,其余生物墨水的打印組織均可以完成打印且延展率較低;改變?nèi)苜|(zhì)和溶劑對打印組織中細胞活性沒有影響,主要影響了細胞的聚集和分化:中、高濃度明膠+中離子強度顯著促進了細胞增殖和聚集,且可以在維持干性的同時促進向汗腺分化,高離子強度墨水中細胞增殖較弱,但可以穩(wěn)定維持細胞干性,高濃度明膠+低離子強度墨水中細胞增殖弱,不能維持干性,但可以促進向表皮角質(zhì)細胞分化。研究結(jié)論:(1)在原有3D打印流程的基礎(chǔ)上,優(yōu)選了打印噴頭(340 μm)、提高了打印溫度(20℃)并篩選了更適合3D打印的海藻酸鈉樣品(C),提高了 3D打印效率和質(zhì)量。(2)初步建立通過改變?nèi)軇㏄BS濃度(或離子強度)調(diào)節(jié)Alg-Gel生物墨水物理性能的方法,溶劑PBS濃度(或離子強度)越高,Alg-Gel生物墨水的黏度和硬度越低,打印組織的形態(tài)保持能力越差,綜上實驗結(jié)果,Alg-Gel生物墨水B-2(溶劑為0.5×PBS,離子強度0.082M)不僅具有良好的可打性,而且打印組織的膨脹率和降解率均較低,可以進行長期體外培養(yǎng)觀察。(3)探索了 Alg-Gel生物墨水溶劑的改變對表皮干細胞生物學(xué)行為的影響。通過排除生物墨水中生物材料的種類、濃度以及溶劑種類的影響,單純改變生物墨水溶劑的離子強度,確定了 Alg-Gel生物墨水B-2的打印組織對表皮干細胞的生物學(xué)行為具有明顯的促進作用:與其他生物墨水相比,B-2明顯提高了表皮干細胞的增殖活性,且在維持干性的同時,促進其向汗腺細胞分化,并且在打印組織中形成細胞聚集的腺樣結(jié)構(gòu)。(4)高濃度明膠(5%)可以促進表皮干細胞向表皮角質(zhì)細胞分化,較高的離子強度(0.156M)可以維持表皮干細胞的干性,適中的明膠濃度和離子強度(3%,0.082M)可以在維持表皮干細胞干性的同時,促進其向汗腺細胞分化。該部分研究為含汗腺3D打印皮膚替代物模型的構(gòu)建提供了充分的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08
【圖文】：

１．２結(jié)果逡逑本研宄以生物３Ｄ打印技術(shù)為基礎(chǔ)，擬研宄生物３Ｄ打印在汗腺再生及皮膚替逡逑代物研發(fā)中的應(yīng)用。如圖１－１邋（Ａ）所示，擠出式生物３Ｄ打印系統(tǒng)目前已廣泛應(yīng)逡逑用于人體多種組織和器官的再生研究。在汗腺再生和皮膚替代物研發(fā)方面，基于逡逑我們實驗小組已有研宄成果，本研宄將遵循如下研究思路，如圖１－１邋（Ｂ）所示：逡逑１．改進操作流程以提高打印效率和打印質(zhì)量；２．改進生物墨水以適應(yīng)細胞行為和組逡逑織發(fā)生；３．創(chuàng)新皮膚替代物構(gòu)建方法以適應(yīng)臨床需求。為實現(xiàn)以上目標，我們首先逡逑對己有的生物３Ｄ打印操作流程進行了改進，為之后的生物墨水和皮膚替代物模型逡逑研宄奠定了重要的基礎(chǔ)。逡逑■１＾逡逑ｙｊＢＢＢｉｉｉｉ＃＇＇＇邋ｎ邋ＫＨＩＢ逡逑Ｂ逡逑（Ｇｅｌ－Ａ？邐}0＿ｉ邐ｂｉｏｐｒｉｍｉｎｇ邐邐逡逑澯邐｜—R釴．逡逑Ｂｉｏ－ｆａｃ．ｏｒ＊ｒ．：Ｖ邋＂邐Ｔ邐＾逡逑（ＰＤ）邐Ｂｉｏｉｎｋ邐擇孑逡逑Ｉ邋Ｃｕｌａｉｒｅ逡逑？ｕｉｖｉ，ｒｏ逡逑．４■扢．逡逑圖１－１．擠出式生物３Ｄ打印系統(tǒng)的組成及生物３Ｄ打印在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用思路。（Ａ）擠出式逡逑生物３Ｄ打印系統(tǒng)的組成；（Ｂ）生物３Ｄ打印在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用思路。逡逑１．２．１生物３Ｄ打印噴頭對細胞活性的影響逡逑２２逡逑

相同打印墨水和相同打印速度的前提下，打印噴頭的內(nèi)徑越小，打印時所需要的逡逑氣壓就越大；由于打印條的直徑不同，因此打印組織的孔徑大小差異明顯，打印逡逑噴頭的內(nèi)徑越小，打印組織的孔隙率就越大。如圖１－２邋（Ａ）所示，在使用鼠表皮逡逑干細胞作為種子細胞時，三種內(nèi)徑的噴頭打印后即刻（Ｄ０）組織中表皮千細胞的逡逑活性有明顯的差異：２１０邋ｙｍ噴頭打印的活細胞比例為８５．２％，明顯低于３４０邋ｕｍ逡逑和４２０邋ｕｍ噴頭打印后的活細胞比例（均＞９０％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義０＜0．0５），逡逑３４０邋ｕ邋ｍ和４２０邋Ｗ邋ｍ噴頭打印后的活細胞比例之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ｐ＞０．０５）。逡逑如圖１－２邋（Ｂ）所示，表皮干細胞在經(jīng)過三種不同打印噴頭時所受到的剪切應(yīng)力明逡逑顯不同：２１０邋ｕｍ噴頭對細胞的剪切應(yīng)力最大，明顯高于３４０邋ｕｍ和４２０邋ｕｍ噴頭，逡逑差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ｐ＜０．０１）；邋３４０邋ｕｍ噴頭對細胞的剪切應(yīng)力稍大于４２０ｕｍ噴逡逑頭，二者差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（／？＞0．0５）。逡逑Ａ邐ｇ邐ｍｉ逡逑１０－Ｔｔ邐邐邐．邐邐邐１邐邐邐ｒ５００逡逑１００１邐ｍ邋ｄｉ邐ｌ邐，逡逑１邋ｉｉｉｉｉｉ邋ｉｉｉｉｉｉ逡逑２１０｜ｊｍ邐３４０Ｍｍ邐４２０ｐｍ邐邐＇邐＾邐邐＾￣４

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7 廣e

本文編號：2730674