【摘要】：目的:本實驗采用細胞膜片技術(shù)以及甲基丙烯酸明膠(GelMA)構(gòu)建預(yù)血管化傷口敷料,將其作用于裸鼠的皮膚缺損處,觀察該敷料對傷口愈合的影響,為臨床中皮膚損傷的修復(fù)提供一種新的治療思路。方法:1)預(yù)血管化細胞膜片的構(gòu)建及表征:提取兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),傳代培養(yǎng)至P2代備用;運用MTT法測定兔BMSCs的生長曲線;檢測兔BMSCs的多向分化能力;培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs);高密度接種兔BMSCs到培養(yǎng)皿培養(yǎng)10天后,接種HUVECs共培養(yǎng)5天,免疫熒光染色觀察預(yù)血管化的細胞膜片內(nèi)I型膠原的形成情況。2)預(yù)血管化細胞膜片復(fù)合GelMA水凝膠敷料的構(gòu)建:光交聯(lián)制備甲基丙烯酸明膠并利用FTIR、XRD等對其理化性質(zhì)進行表征,將預(yù)血管化細胞膜片進行折疊至三層并與GelMA水凝膠共培養(yǎng)構(gòu)建預(yù)血管化傷口敷料。3)預(yù)血管化敷料運用于裸鼠傷口愈合的實驗:構(gòu)建裸鼠全層皮膚缺損模型,將構(gòu)建的預(yù)血管化敷料作用于裸鼠傷口,分別在第1天、第7天、第14天觀察傷口愈合情況,并提取傷口處組織樣品進行組織學(xué)染色,研究此敷料對宿主傷口愈合的影響。結(jié)果:1)倒置光學(xué)顯微鏡下可觀察到兔BMSCs呈長梭形,MTT實驗結(jié)果示兔BMSCs的生長曲線成“S”形;多向分化實驗結(jié)果示兔BMSCs具有向成脂、成骨、成軟骨細胞分化的能力;免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BMSCs膜片中細胞含量較高,細胞外基質(zhì)豐富,細胞與細胞之間連接存在,含有大量的I型膠原纖維;在預(yù)血管化細胞膜片上,HUVECs在水平、垂直方向上均發(fā)生遷移并在BMSCs上形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,BMSCs膜片為HUVECs的生長和遷移提供了3D環(huán)境。2)FTIR結(jié)果表明甲基丙烯酸對明膠蛋白骨架結(jié)構(gòu)沒有顯著影響,BMSCs在GelMA水凝膠的細胞相容性實驗中表現(xiàn)出較高的成活率。3)裸鼠背部預(yù)血管化構(gòu)建體移植成功,實驗組愈合速度快于對照組;免疫組織化學(xué)染色進一步顯示,在預(yù)血管化構(gòu)建體中體外預(yù)先形成的微血管結(jié)構(gòu)與宿主脈管系統(tǒng)發(fā)生吻合。結(jié)論:實驗結(jié)果表明由預(yù)血管化干細胞膜片與GelMA水凝膠構(gòu)建的新型皮膚敷料在免疫缺陷鼠的皮膚缺損修復(fù)再生實驗中顯示出具有促進傷口愈合的功能,但仍需大量的基礎(chǔ)實驗及臨床研究進一步探究其促進傷口愈合的機制。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08
【圖文】：

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 預(yù)血管化細胞膜片復(fù)合 GelMA 水凝膠傷口敷料的構(gòu)建及其基礎(chǔ)應(yīng)用的研究時可以促進管腔的形成并能夠保持其長期穩(wěn)定性[42]。在研究當歸（AS）提取物對體外人內(nèi)皮細胞（HUVECs）和體內(nèi)斑馬魚的血管生成作用時發(fā)現(xiàn) AS 提取物可以促進 HUVECs 的數(shù)量、遷移量和血管平均長度的顯著增加[43]。共培養(yǎng)HUVECs 和多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）來構(gòu)建體外 3D 血管模型，并探究 VEGF在該模型中介導(dǎo)毛細血管等小血管形成中的作用，發(fā)現(xiàn) GBM 分泌的 VEGF 能夠誘導(dǎo) HUVECs 形成微血管腔[44]。綜上，研究發(fā)現(xiàn)，雖然 HUVECs 是生物組織工程中重要的血管形成細胞，但是單獨的 HUVCEs 無法獨立完成血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，因此需要特定的細胞外基質(zhì)，其中含有各種促進血管生成的生長因子，最好是該細胞外基質(zhì)自身能夠持續(xù)不斷地自發(fā)的去生成血管生成所需要的生長因子以及其他介質(zhì)，在目前的研究中發(fā)現(xiàn) MSCs 作為外周細胞可以通過自生的分泌為內(nèi)皮細胞的血管化提供所需的各種介質(zhì)，已經(jīng)成為組織再生血管構(gòu)建中十分重要的血管周圍細胞。

而 VEGF 分泌幾乎保持恒定[73]。VEGF 和 HGF 分泌物之間的對比結(jié)果也可能與多層 HSMM 片中的缺血情況有關(guān)。眾所周知，低氧誘導(dǎo) VEGF 分泌[74]，并且在常氧條件下促進 HGF 分泌[75]。有研究發(fā)現(xiàn)將細胞膜片技術(shù)和靜電紡絲支架結(jié)合起來，快速構(gòu)建出能夠立即表達收縮基因的周向排列的人體主動脈平滑肌細胞的管狀構(gòu)建體，用于培養(yǎng)工程化血管組織結(jié)構(gòu)[76]。也有研究發(fā)現(xiàn)在預(yù)血管3D 組織結(jié)構(gòu)中，用內(nèi)皮細胞集落形成細胞（Endothelial cell colony forming cells,ECFCs）代替人臍帶血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）與成纖維細胞膜片共培養(yǎng)后 3 天在成纖維細胞片構(gòu)建體中發(fā)現(xiàn)了管腔結(jié)構(gòu)[47]。Kang 等將細胞膜片技術(shù)與組織工程支架技術(shù)進行了結(jié)合來構(gòu)建高水平的血管組織，基于細胞膜片工程技術(shù)整合血管化的仿生細胞膜片工程骨膜（CSEP）和可生物降解的大孔 β-磷酸三鈣（β-TCP）支架來設(shè)計血管化骨移植物骨膜（如圖 1.2），該構(gòu)建體不僅能夠模仿天然骨膜的空間構(gòu)型，而且還能促進骨移植物的血管化和成骨潛能[38]。因此，細胞膜片技術(shù)在目前生物組織工程的構(gòu)建中十分重要的，特別是預(yù)血管化細胞膜片的構(gòu)建。

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本文編號：2719765