【摘要】：研究目的與背景:皮下軟組織缺損雖不是特別棘手的臨床問題,但卻因其在臨床上尤為常見,一直困擾著臨床醫(yī)生,據(jù)美國整形外科協(xié)會報道,僅2015年一年修復重建類手術便有逾580萬例。傳統(tǒng)治療手段經(jīng)常是“拆東補西”,造成供體部位局域的組織畸形、感染和移植組織不存活等問題。組織工程學是最有前景的方法。組織工程構架中必不可少的三要素之一就是組織工程支架,并且,理想的支架材料應具有一定三維結構和細胞外基質(ECM)的功能。本研究主旨在深入探討和研發(fā)新型組織工程支架用于皮下軟組織缺損的修復。因豬小腸粘膜下層(Porcine small intestinal submucosa,P-SIS)的脫細胞基質具有很好的組織相容性和生物活性,且豬小腸粘膜下層易于獲得,成本較低,來源充足,本課題組前期制備了P-SIS的冷凍凝膠等材料,可用于皮下軟組織缺損的修復,然而P-SIS的降解時間較快,或用化學交聯(lián)的方法延長其降解時間,這種方法容易發(fā)生化學交聯(lián)劑殘留,影響細胞存活。隨著材料學的發(fā)展和深入研究,越來越多的生物可降解聚合物被用于醫(yī)療領域,聚對二氧環(huán)己酮(poly(p-dioxanone),PPDO)是脂肪族聚酯的一種,由于它的分子鏈上含有醚鍵,所以具有良好柔韌性、較強抗張強度、高打結強度等特點。在上世紀70年代后期被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于外科縫合線材料,除上述特點,還具備降解時間緩慢,其降解產(chǎn)物與人體代謝產(chǎn)物一致,可完全被排出體外等優(yōu)點。然而,其親水性不好導致加工困難,并限制了它的開發(fā)與應用。因此本課采用了細胞外基質P-SIS和生物可降解PPDO為基材,制備了一種新型三維多孔支架材料,不僅具備細胞外基質的特性,還具備降解緩慢、拉伸強度高的特性,適合用做皮下軟組織缺損的修復。研究方法:第一部分:脫細胞基質的制備、相關性能檢測及脫細胞基質的選擇1.豬心包膜脫細胞基質膜(P-PC)和豬小腸粘膜下層脫細胞基質膜(P-SIS)的制備以及相關檢測,包括:DNA殘留檢測提取與鑒定有無細胞殘留,外觀特征大體觀察,掃描電子顯微鏡觀察微觀結構,力學性能分析等;2.根據(jù)以上實驗結果以及文獻檢索進行綜合性分析,針對本課題需求,最終選擇了P-SIS作為本課題復合支架的天然生物基質成分;3.P-SIS粉末的制備。第二部分:PPDO-SIS復合多孔支架的制備1.PPDO溶解實驗,PPDO難溶于一般有機溶劑,故找到一種合適的有機溶劑用于復合材料的制備是必要的;2.PPDO成膜實驗;3.PPDO-SIS復合支架的制備;4.PPDO-SIS復合支架的表征與微觀結構,并與PPDO膜進行對照分析;5.PPDO-SIS復合支架的成分特征檢測(采用傅里葉紅外光譜分析FTIR和X射線衍射圖譜分析XRD),并與P-SIS膜和PPDO膜進行對照分析;6.PPDO-SIS復合支架的力學性能檢測(對照組同上);7.PPDO-SIS復合支架的熱重分析(對照組同上);8.PPDO-SIS復合支架在58℃的蛋白酶K溶液中和37℃的磷酸鹽緩沖液PBS中的降解率測定(對照組同上);9.PPDO-SIS復合支架的吸水性檢測(對照組同上)。第三部分:PPDO-SIS復合多孔支架的體外生物學觀察1.綠色熒光轉基因小鼠脂肪間充質干細胞(ADSCs)的分離培養(yǎng);2.PPDO-SIS支架材料與ADSCs的體外復合培養(yǎng);3.CCK-8試劑盒檢測細胞活性與增殖(P-SIS膜、PPDO膜為對照組);4.掃描電鏡(SEM)觀察細胞狀態(tài)。第四部分:PPDO-SIS復合多孔支架的體內(nèi)實驗觀察1.制作小鼠皮下軟組織缺損模型,實驗分四個組:P-SIS膜組、PPDO-SIS復合支架組、PPDO膜組和空白對照組,將P-SIS膜、PPDO-SIS復合支架、PPDO膜分別埋置在小鼠皮下,觀察各組材料對皮下軟組織缺損的修復作用。2.通過組織切片的HE染色、免疫熒光檢測CD34和免疫組織化學檢測各組材料中CD90表達和Western blot檢測CD31和VEGF表達情況,觀察分析PPDO-SIS復合支架移植后的局部促血管化和細胞增殖情況。研究結果:1.制備出脫細胞的P-PC膜、P-SIS膜和P-SIS粉末。P-SIS粉末更利于復合支架的制備工藝要求。2.成功制備出PPDO-SIS復合支架。該支架經(jīng)SEM觀察,具有三維多孔結構,孔壁有微孔,在材料內(nèi)部可實現(xiàn)互通。PPDO-SIS復合支架材料具有良好的吸水性能,與生物基質P-SIS膜相比,比P-SIS膜的吸水性稍高,與高分子聚合物PPDO膜相比,其吸水性能遠高于高分子PPDO膜,且具統(tǒng)計學意義(p0.05)。FTIR檢測PPDO-SIS復合支架顯示波數(shù)為1736cm~(-1)的C=O伸縮振動吸收峰,在1221cm~(-1)、1126cm~(-1)、1052cm~(-1)顯示了C-O伸縮振動峰,說明共混后的PPDO-SIS復合支架依然保有PPDO的化學結構特征。XRD結果顯示PPDO-SIS復合支架的X射線衍射峰主要出現(xiàn)在2θ角為21.92°、23.78°和29.12°,證實了P-SIS的混入對PPDO-SIS復合材料的晶體類型并沒有影響,依舊顯示的是PPDO的特征衍射峰。PPDO-SIS復合支架的應變率較P-SIS膜有所增加,可以滿足皮下軟組織缺損修復的力學要求。在蛋白酶K溶液中,48小時P-SIS的降解率高達近85%,PPDO-SIS復合支架約為10%,PPDO膜的降解率不到1%,通過統(tǒng)計分析得出,PPDO-SIS復合支架和P-SIS膜的降解率始終都有極為顯著差異(P0.01%),和PPDO膜在12h時的降解率開始存在顯著差異(P0.05%),隨著降解時間的增加,這種差異趨于更為顯著(P0.01%),這和PPDO-SIS復合支架中含有P-SIS成分有很大關系。PBS緩沖液中體外降解率實驗結果顯示,雖然PPDO-SIS復合支架材料與PPDO膜在四個時間觀察點(1w、2w、3w、4w)的降解速率均存在極為顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01%),但是,PPDO-SIS復合支架在4w時的降解率也僅為25%。PPDO-SIS復合支架材料具有良好的吸水性能,比P-SIS膜稍高,與PPDO膜相比,其吸水性能遠比高分子PPDO膜要高,且具統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察結果可見帶有綠色熒光的ADSCs細胞在P-SIS膜、PPDO-S復合支架材料以及PPDO膜上均能廣泛分布生長,通過掃描電子顯微鏡可以清晰的看到細胞形態(tài)呈梭形,伸展良好,特別是可見ADSCs在PPDO-SIS復合支架的孔壁上生長。通過CCK-8試劑盒測試出的24h PPDO-SIS復合支架與PPDO膜存在著顯著差異(P0.05)。測出第1d、3d、5d、7d的CCK-8吸光度顯示了各組材料的細胞增殖情況,P-SIS膜的細胞增殖最好,PPDO-SIS復合支架也較好,PPDO膜最差,但隨著時間的推移,PPDO-SIS復合支架的細胞增殖與P-SIS膜的細胞增殖情況從極為顯著差異(P0.01)轉變?yōu)轱@著差異(P0.05),然而,PPDO膜與PPDO-SIS復合支架在任何時間觀測點均存在極為顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01)。4.不同支架材料埋置于小鼠的皮下軟組織缺損部位,結果顯示,P-SIS膜、PPDO-SIS復合支架、PPDO膜在小鼠體內(nèi)均具有良好的組織相容性,都可以很好的生長,但在2周時,P-SIS就已經(jīng)吸收的無定態(tài)形狀,而PPDO-SIS復合支架仍保持原有的方形,在4周時仍能觀察PPDO-SIS復合支架組和PPDO膜組仍分別有(0.57+0.06)cm和(0.55+0.07)cm,兩者在剩余大小上沒有顯著差別�？瞻讓φ战M在2周和4周時,小鼠背部仍能明顯可以觀察到皮下軟組織缺損的凹陷。2周和4周的HE染色組織病理形態(tài),各材料組均可見中性粒細胞浸潤,P-SIS膜組和PPDO-SIS復合支架組更為明顯。未能觀察到P-SIS膜的殘留,證實了P-SIS在體內(nèi)吸收較快,另外,PPDO-SIS復合支架的孔壁可見細胞聚集,在4周時,各材料組均可見明顯新生血管。CD34免疫熒光染色結果顯示,P-SIS膜組、PPDO-SIS復合支架組和PPDO膜組均有CD34的陽性表達,并與空白對照組均有顯著差異(P0.05)。免疫組化結果顯示PPDO-SIS復合支架的CD90表達明顯高于空白對照組(P0.05)。CD31和VEGF的Western blot檢測結果顯示不同材料均明顯高于空白組(P0.05)。結論:1.成功制備出的PPDO-SIS復合支架具有良好的三維多孔結構,理化性能符合組織工程支架要求。2.PPDO-SIS復合支架與ADSCs的體外復合培養(yǎng)證實PPDO-SIS復合支架具有良好的促細胞生長、增殖作用,可用于體內(nèi)移植。3.PPDO-SIS復合支架材料體內(nèi)降解緩慢,在空間上能起到占位性修復作用,支架可有效促進移植部位的血管化,利于細胞再生,可有效解決皮下軟組織缺損的修復。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：2670812