【摘要】：心血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的常見病,世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結(jié)果顯示全球范圍內(nèi)每年有一千多萬人死于心血管疾病,占死亡總?cè)藬?shù)的30%,心血管疾病已是全球第一致殘致死疾病。我國2016年心血管疾病報告指出中國心血管疾病患者數(shù)量呈持續(xù)上升趨勢,其死亡率高于腫瘤等其他疾病,居于首位。即使應(yīng)用目前最先進、完善的治療手段,仍有50%以上的心血管疾病幸存者生活不能完全自理。導致心血管疾病發(fā)生的主要原因是血管動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)引起的動脈梗阻或狹窄,因此深入研究動脈粥樣硬化的形成機制對提高心血管疾病的防治具有至關(guān)重要的意義。動脈粥樣硬化是一種高度偏好性的血管疾病,它多發(fā)于動脈血管彎曲與分叉位置,這些位置多為血流流場紊亂的低震蕩切應(yīng)力區(qū)域,這說明動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展與血流動力學因素密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)血流流場紊亂引發(fā)的血管壁細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變是導致AS形成的重要因素。血管內(nèi)皮細胞對脂質(zhì)攝取過多會導致脂質(zhì)在動脈內(nèi)膜下沉積,促進動脈粥樣斑塊的形成,故內(nèi)皮細胞對脂質(zhì)的攝取量在AS形成中也起著至關(guān)重要的作用。有研究顯示血管壁脂質(zhì)沉積與血流流速及切應(yīng)力可能存在相關(guān)性,但其具體的調(diào)控機制并不清楚,所以本研究以低震蕩切應(yīng)力為主線,研究其對血管內(nèi)脂質(zhì)攝取及沉積的影響及相關(guān)分子機制,這將有助于解析切應(yīng)力影響AS發(fā)生發(fā)展的生物學機制,并且有可能為AS的治療提供潛在的新靶點。在本課題研究中,通過對Apo E~(-/-)小鼠頸總動脈進行結(jié)扎手術(shù)構(gòu)建了小鼠低震蕩切應(yīng)力模型,并通過小動物超聲檢測其血流狀態(tài)以確保模型構(gòu)建成功。通過蛋白組學方法檢測了低震蕩切應(yīng)力與層流切應(yīng)力下血管組織蛋白的差異表達情況,并進行了相關(guān)信號通路分析,發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力可能通過影響脂質(zhì)吸收及炎癥反應(yīng)等過程影響AS的發(fā)生發(fā)展。進一步構(gòu)建Apo E~(-/-)小鼠低震蕩切應(yīng)力模型檢測其血管內(nèi)斑塊形成、脂質(zhì)堆積、內(nèi)皮細胞脂質(zhì)吸收等情況,并通過在體及體外實驗研究了Id1蛋白在低震蕩切應(yīng)力引起的脂質(zhì)吸收過程中的作用及相關(guān)分子機制。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1.構(gòu)建Apo E~(-/-)小鼠頸動脈低震蕩切應(yīng)力模型,并通過小動物超聲方法檢測其頸動脈血流流速,結(jié)果顯示對左頸動脈分支進行結(jié)扎后,左頸總動脈血管內(nèi)血流流速降低并且出現(xiàn)兩個呈相反方向的血流,此時血管內(nèi)的切應(yīng)力為往復的低震蕩切應(yīng)力,而對側(cè)進行假手術(shù)的右頸總動脈血管內(nèi)為單一方向的血流,血管內(nèi)的切應(yīng)力為層流切應(yīng)力。分別提取了兩側(cè)頸動脈血管的總蛋白,通過iTRAQ方法檢測層流切應(yīng)力及低震蕩切應(yīng)力下血管差異蛋白表達譜,結(jié)果顯示相對于層流切應(yīng)力,低震蕩切應(yīng)力下有168個差異表達蛋白,其中150個蛋白上調(diào),18個蛋白下調(diào)。通過GO富集分析及KEGG信號通路分析方法對這些蛋白的功能及涉及的信號通路進行分類及預測,結(jié)果顯示這些差異蛋白與大分子代謝和運輸過程、脂肪消化及吸收過程以及炎癥反應(yīng)等密切相關(guān),暗示低震蕩切應(yīng)力可能通過調(diào)控這些過程影響AS的形成。由于脂質(zhì)代謝異常與AS發(fā)生密切相關(guān),所以我們后續(xù)將進一步通過在體及體外實驗驗證低震蕩切應(yīng)力是否可以影響血管內(nèi)的脂質(zhì)沉積吸收從而促進斑塊形成。2.對Apo E~(-/-)小鼠頸動脈低震蕩切應(yīng)力模型進行血漿脂蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)手術(shù)形成的低震蕩切應(yīng)力對小鼠血液中的脂蛋白含量沒有明顯的影響。通過對小鼠左頸及右頸動脈血管組織進行HE染色后發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加,進行了結(jié)扎手術(shù)的左頸總動脈血管(低震蕩切應(yīng)力)內(nèi)膜逐漸增厚,到第10周時AS斑塊幾乎堵塞整個血管,而對側(cè)右頸動脈(層流切應(yīng)力)以及對照組血管(層流切應(yīng)力)內(nèi)膜厚度沒有明顯變化。對頸總動脈血管進行油紅O染色后發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力可以促進血管壁脂質(zhì)堆積,并且隨著結(jié)扎時間的增加,脂質(zhì)堆積越來越嚴重。對頸總動脈血管組織切片進行CD31及BODIPY熒光染色檢測血管內(nèi)皮細胞中的脂質(zhì)吸收情況,結(jié)果顯示進行結(jié)扎手術(shù)后的左頸總動脈(低震蕩切應(yīng)力)內(nèi)皮細胞吸收的脂質(zhì)明顯高于對側(cè)的右頸動脈(層流切應(yīng)力)及對照組頸總動脈(層流切應(yīng)力)內(nèi)皮細胞,并且隨著結(jié)扎時間的延長,低震蕩切應(yīng)力組的血管內(nèi)皮細胞吸收的脂質(zhì)也越來越多。對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)進行力學加載后檢測其脂質(zhì)吸收情況,結(jié)果顯示低震蕩切應(yīng)力能夠促進內(nèi)皮細胞對脂質(zhì)的吸收,這與在體實驗結(jié)果一致。將力學處理及LDL吸收后的細胞與THP-1細胞進行共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力處理及隨后的LDL吸收可以促進內(nèi)皮細胞與THP-1細胞的粘附,而Ki67免疫熒光染色實驗說明低震蕩切應(yīng)力處理及隨后的LDL吸收可以促進內(nèi)皮細胞增殖。低震蕩切應(yīng)力及隨后的LDL吸收引起的內(nèi)皮細胞增殖及炎癥反應(yīng)可能參與了AS形成過程。3.我們實驗室已有研究暗示分化抑制因子1(Id1)蛋白是力學敏感的轉(zhuǎn)錄因子并且與脂質(zhì)代謝過程密切相關(guān),所以我們以Id1為研究對象,分析其是否參與了OSS調(diào)控的脂質(zhì)吸收過程。對結(jié)扎24小時及48小時的小鼠頸動脈進行en face染色檢測Id1蛋白在血管內(nèi)皮細胞中的表達情況,我們發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力抑制Id1蛋白的表達。對人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行體外力學加載后,Western blot檢測Id1蛋白的表達情況,結(jié)果顯示層流切應(yīng)力促進Id1蛋白的表達,并且隨著加載時間的延長,蛋白表達量也逐漸增加,到第12小時表達量達到頂峰,而低震蕩切應(yīng)力下,Id1蛋白表達瞬間增加,但隨著加載時間的延長,Id1蛋白的表達最終受到抑制。對Id1過表達細胞進行體外力學加載并檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)吸收情況,結(jié)果顯示Id1過表達能夠抑制低震蕩切應(yīng)力調(diào)控的脂質(zhì)吸收過程。4.為了解析Id1通過何種機制參與低震蕩切應(yīng)力調(diào)控的脂質(zhì)吸收過程,我們使用IPA軟件進行了相關(guān)預測分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AS形成過程中,Id1調(diào)控了許多炎癥因子,如NF-κB、TNF、ICAM等的表達,此外,Id1還與脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白關(guān)系密切,可能調(diào)控了低密度脂蛋白受體LDLR的表達�；诖�,我們通過在體及體外實驗研究了Id1是否會通過調(diào)控LDLR的表達影響細胞脂質(zhì)吸收過程。對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的Id1蛋白進行過表達及干擾處理后檢測LDLR的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)Id1過表達后LDLR蛋白表達被抑制,細胞脂質(zhì)吸收降低;而Id1被干擾后LDLR蛋白表達明顯增加,細胞脂質(zhì)吸收也顯著增加。同時干擾Id1及LDLR后,Id1干擾導致的脂質(zhì)吸收被抑制,這說明Id1異常表達導致的脂質(zhì)吸收變化是通過調(diào)控LDLR蛋白實現(xiàn)的。在體en face染色及體外Western blot檢測了層流切應(yīng)力及低震蕩切應(yīng)力下LDLR的表達情況,結(jié)果顯示低震蕩切應(yīng)力促進LDLR蛋白表達,體外結(jié)果發(fā)現(xiàn)層流切應(yīng)力下LDLR表達瞬間增加,但隨著加載時間的延長,其表達則被抑制,而低震蕩切應(yīng)力可以持續(xù)激活LDLR蛋白的表達。將LDLR干擾后,低震蕩切應(yīng)力誘導的脂質(zhì)吸收被抑制,說明低震蕩切應(yīng)力通過調(diào)控LDLR的表達影響細胞對脂質(zhì)的吸收。體外免疫熒光及Western blot實驗檢測了LDLR及Id1的表達模式,與靜態(tài)相比力學加載24小時后,層流切應(yīng)力促進Id1的表達而抑制LDLR的表達;相反,低震蕩切應(yīng)力抑制Id1的表達而促進LDLR的表達,說明Id1及LDLR均受到低震蕩切應(yīng)力調(diào)控,且呈負相關(guān)趨勢。對Id1過表達細胞進行力學加載后,檢測細胞內(nèi)LDLR的表達情況,結(jié)果顯示Id1過表達抑制了低震蕩震蕩切應(yīng)力對LDLR的促進作用,說明Id1參與了低震蕩切應(yīng)力對LDLR的調(diào)控過程。由于Id1蛋白需要通過與b-HLH蛋白相結(jié)合才能起作用,所以我們檢測了調(diào)控LDLR表達的轉(zhuǎn)錄因子SREBP1(屬于b-HLH蛋白家族成員)與Id1的關(guān)系,Western blot結(jié)果顯示Id1過表達及干擾細胞中SREBP1的蛋白表達沒有明顯變化,而免疫共沉淀及熒光共定位結(jié)果顯示Id1與SREBP1存在物理上的結(jié)合,這種物理的結(jié)合可能參與了Id1對LDLR的調(diào)控過程。綜上所述,本研究綜合運用蛋白組學、生物力學、病理生理學、細胞分子生物學等方法,通過構(gòu)建小鼠頸動脈結(jié)扎模型,研究低震蕩切應(yīng)力對血管脂質(zhì)沉積、脂質(zhì)吸收及斑塊形成的影響,同時結(jié)合體外實驗研究了OSS引起的脂質(zhì)吸收過程中Id1蛋白的作用。本研究工作一定程度上闡明了Id1參與低震蕩切應(yīng)力調(diào)控血管內(nèi)皮細胞脂質(zhì)吸收的分子機制,這將為深入了解和認識AS易發(fā)生在血管低震蕩切應(yīng)力區(qū)域提供一些新的科學依據(jù)。
【圖文】：

：鈍性分離氣管左側(cè)肌肉，找到左動脈伴行的迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)，LCA），沿著頸總動脈直到找到 ，ECA），頸內(nèi)動脈（Internal caroA）和甲狀腺上動脈（Superior thyr剖的時候要非常小心。用 9-0 縫線結(jié)甲狀腺上動脈（如圖 2.1 所示），右行分離并找到 4 個分支血管，但不中，左側(cè)及右側(cè)頸動脈都只進行分2 萬單位的慶大霉素注射液沖洗，，逐碘在切口處消毒；鼠放在加熱室保暖，直到蘇醒，避

圖 2.2 結(jié)扎模型手術(shù)后 48 小時可以誘導低震蕩切應(yīng)力形成。（A）結(jié)扎 48 小時后，通動物超聲檢測右頸動脈（RCA）及左頸動脈（LCA）血管內(nèi)血液情況。（B）統(tǒng)計分析 RC及 LCA 的血流流速大�。╪=3）。**p<0.001 表示與 RCA 相比有顯著差異。Fig 2.2 Theligation model can be induced OSS 48 hours later after partial ligated. (A)Ultrasonography was used to detect the right and left carotid artery blood flow velocities 48 hourafter building the model. (B) Quantitative analysis the velocities of RCA and LCA (n=3).**p<0.001vs the RCA controls.2.3.2 不同力學條件下的血管組織蛋白樣品制備為了研究不同力學情況下血管組織蛋白組差異情況，我們將小鼠血管分成：LCA 組和 RCA 組。通過小動物超聲確定結(jié)扎血管 48 小時后 LCA 可以形成蕩切應(yīng)力（OSS），而 RCA 為層流切應(yīng)力（LSS）。我們分別將手術(shù)后 48 小小鼠左頸及右頸總動脈進行分離提取蛋白，并將樣品送于華大基因公司使用素標記相對和絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantificationTRAQ）方法進行蛋白質(zhì)組差異分析及鑒定。
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.01;R543.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張艷萍;胡睿;;心腦血管疾病預防 未來“主戰(zhàn)場”在社區(qū)[J];中國社區(qū)醫(yī)師;2010年28期

2 危當恒;王貴學;唐朝君;葉林奇;楊力;鄧林紅;劉錄山;王佐;唐朝克;;狹窄血管遠心端低密度脂蛋白濃度極化促進動脈粥樣硬化形成[J];生理學報;2007年06期

3 張春妮,MiyazakiAkira,HakamataHideki,SakaguchiHisashi,HoriuchiSeikoh;低密度脂蛋白受體基因敲除鼠極低密度脂蛋白和中間密度脂蛋白組分誘導J774巨噬細胞膽固醇酯蓄積[J];中國動脈硬化雜志;1999年04期

本文編號：2667356