【摘要】：數(shù)字式生物檢測(cè)方法由于靈敏度高、能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的絕對(duì)計(jì)數(shù),近年來(lái)成為體外診斷領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。目前的數(shù)字式生物檢測(cè)方法(數(shù)字PCR和數(shù)字ELISA)主要通過(guò)物理隔離的方式將目標(biāo)待測(cè)生物分子限制在較小空間以提高單位體積的待測(cè)分子濃度,從而實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)的目的。然而,物理隔離方法(如微陣列芯片和微液滴)增加了檢測(cè)體系的復(fù)雜度以及芯片制造成本,另外生物檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性控制難度也大幅提高。因此,本文采用超亮共軛聚合物納米粒子作為信號(hào)標(biāo)記材料,旨在建立一個(gè)基于微球的不需額外物理分隔的數(shù)字式生物檢測(cè)方法。首先,制備超亮共軛聚合物納米顆粒并作為生物檢測(cè)信號(hào)標(biāo)記單元。通過(guò)共軛聚合物PFBT與梳狀兩親性聚合物PS-PEG-COOH共沉淀制備一系列不同粒徑的共軛聚合物納米粒子(CPNs),并探究其熒光性質(zhì)隨粒徑的變化規(guī)律。研究結(jié)果表明,隨粒徑增大,CPNs能保持穩(wěn)定、優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì),其單顆粒熒光強(qiáng)度隨粒徑的平方線性增長(zhǎng)。粒徑為140 nm的CPNs能達(dá)到激光共聚焦顯微鏡的檢測(cè)限且粒徑相對(duì)較小,優(yōu)選并確定為本研究的信號(hào)標(biāo)記材料。其次,建立基于微球的數(shù)字式生物檢測(cè)模式平臺(tái)。分別在微球和共軛聚合物納米粒子上修飾鏈霉親和素(SA)和生物素,得到偶聯(lián)SA的微球(微球-SA)和生物素化的CPNs(CPNs-biotin)。將CPNs-biotin以一定比例加入到微球-SA反應(yīng)體系中進(jìn)行親和反應(yīng),由于添加的CPNs-biotin數(shù)目遠(yuǎn)低于微球-SA數(shù)目,確保了每個(gè)微球表面結(jié)合的CPNs-biotin至多1個(gè)。隨后,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)每個(gè)微球上的CPNs的熒光信號(hào),結(jié)合CPNs-biotin的微球作為信號(hào)“1”,未結(jié)合CPNs-biotin的微球作為信號(hào)“0”,統(tǒng)計(jì)連接有CPNs熒光的微球數(shù)占總微球數(shù)的比例,通過(guò)泊松分布計(jì)算投入CPNs-biotin濃度,由此實(shí)現(xiàn)數(shù)字式生物檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)合到微球上的CPNs-biotin數(shù)目服從泊松分布,且模擬生物檢測(cè)的檢測(cè)限達(dá)到18 aM,因此從原理上驗(yàn)證了本文提出的基于微珠的數(shù)字式生物檢測(cè)方法的可行性。最后,本文以人絨毛膜促性腺激素(hCG)為待測(cè)蛋白目標(biāo)分子,分別將捕獲抗體和標(biāo)記抗體偶聯(lián)在微球和CPNs表面,并以微球?yàn)榉磻?yīng)載體,同時(shí)以CPNs為檢測(cè)信號(hào)單元,建立了微球基三明治夾心數(shù)字式生物檢測(cè)方法(Beads-Digital ELISA),并初步探究了該方法的可行性。綜上,本文建立的基于微球的數(shù)字式生物檢測(cè)方法具有超高的檢測(cè)靈敏度,在體外檢測(cè)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。
【圖文】：

解控二氧化硅納米粒子的 TEM 圖像，標(biāo)尺 100的納米粒子粒徑分布圖。[16]ive TEM images showing the mesoporous structur (b) Particle size distribution obtained with the DL[17, 18]另辟蹊徑，，利用常用熒光染料羅丹米粒子，再通過(guò)熟化形成納米粒子的團(tuán)個(gè)染料摻雜的納米粒子粒徑在 3 nm 左右。根據(jù)圖 1- 2 (b)，所合成的染料摻雜的羅丹明 6G 的 212 倍，是 30 nm CdSe@, 14]將熒光分子 BODIPY 與苯乙烯在大行 RAFT 聚合，合成了粒徑為 70 nm 的熒光強(qiáng)度是量子點(diǎn)的 200-2000 倍。

圖 1- 3 CdTe/CdS/ZnS 量子點(diǎn)配體轉(zhuǎn)換的過(guò)程示意圖。[22]Fig. 1-3 Reaction scheme of CdTe/CdS/ZnS QDs ligand exchange.了獲得更高熒光強(qiáng)度的量子點(diǎn)，Sheng 等人[27]將 CdSe 量子點(diǎn)制成納米簇 CdSe 量子點(diǎn)表面修飾生物素，再向體系中加入鏈霉親和素，由于一個(gè)鏈能與 4 個(gè)生物素反應(yīng)，所以鏈霉親和素能將修飾生物素的不同量子點(diǎn)團(tuán)，形成 86 nm 左右的納米簇，最后通過(guò) SA 和生物素的親和反應(yīng)修飾上胞的適配體，用于癌細(xì)胞的檢測(cè)。與單顆粒量子點(diǎn)相比，這種量子點(diǎn)納光檢測(cè)信號(hào)高出了 14 倍。有研究者將量子點(diǎn)裝載到氧化硅小球，使得納米粒子上富集量子點(diǎn)，極顆粒的熒光強(qiáng)度。如圖 1- 4 所示，Qian 等人[28]和 Wu 等人[29]將量子點(diǎn)通聯(lián)結(jié)合在氧化硅小球表面，粒徑為 100 nm 左右，在其上修飾二抗作為信料通過(guò)電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行免疫檢測(cè)，使檢測(cè)信號(hào)得到 6.6 倍的放大。外，Ranzoni等研究人員[27]通過(guò)溶脹法將量子點(diǎn)摻雜到PS球中，形成200 “番木瓜粒子”（如圖 1- 5 所示），其中裝載了約 10000 個(gè)量子點(diǎn)，再通過(guò)合物修飾表面使其具備官能團(tuán)用于接下來(lái)的生物修飾。在登革熱免疫分，它比市售最佳檢測(cè)試劑的信號(hào)強(qiáng)度高出 4 倍，將檢測(cè)限提高了 15 倍。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

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