【摘要】：目的:口腔種植現(xiàn)今已成為重要的口腔修復(fù)方式,其中鈦及鈦合金是目前最常用的口腔種植材料。然而在其應(yīng)用過程中,種植失敗時有發(fā)生,這與人體復(fù)雜的體液環(huán)境有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn),金屬鈮作為一種耐蝕性良好的生物材料,在耐口腔氟離子腐蝕方面彌補了鈦及鈦合金的不足。種植體植入之后,組織愈合過程產(chǎn)生炎癥反應(yīng),炎癥過程產(chǎn)生的氧化應(yīng)激環(huán)境,可能加速金屬腐蝕,金屬的腐蝕產(chǎn)物會對周圍細胞產(chǎn)生一系列毒性作用。所以金屬生物材料在應(yīng)用前,有必要評價其在氧化應(yīng)激條件下的細胞毒性。本實驗?zāi)康氖且越饘兮伜途郾揭蚁閷φ?研究金屬鈮在雙氧水誘導的氧化應(yīng)激條件下對Ea.hy926細胞的毒性作用。為金屬鈮作為一種新的口腔種植材料提供依據(jù)。方法:1.細胞培養(yǎng)EA.hy926人臍靜脈內(nèi)皮細胞株購于上海中科院細胞庫,培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃(5%CO_2)環(huán)境。所有實驗均使用24孔板,每種材料表面接種1mL細胞,細胞密度為50,000/mL。培養(yǎng)兩天后,改用含不同濃度雙氧水的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1或24小時。2.細胞氧化應(yīng)激模型建立實驗使用24孔板,每種材料表面接種1mL細胞,細胞密度為50,000/mL。培養(yǎng)兩天之后,通過光鏡觀察細胞匯合度達到80%。改為含0,0.1,0.2,0.5mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時。CCK-8法檢測細胞活力。3.金屬材料制備實驗采用直徑為15mm,厚度為2mm金屬鈮片和金屬鈦片。金屬表面打磨拋光至平均粗糙度小于20nm.使用前用1%曲拉通,無水丙酮,無水乙醇超聲各20分鐘,高溫高壓滅菌。4.細胞毒性檢測使用24孔板,細胞接種于不同材料表面,方法如上。經(jīng)過兩天培養(yǎng)后,改用含0,0.1,0.2 mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。CCK-8法檢測細胞活力。5.細胞凋亡檢測使用24孔板,細胞接種于不同材料表面,方法如上。經(jīng)過兩天培養(yǎng)后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集細胞,分別加入FITC標記的Annexin V和PI染色,應(yīng)用流式細胞儀來檢測各組凋亡率。6.細胞骨架染色使用24孔板,細胞接種于不同材料表面,方法如上。經(jīng)過兩天培養(yǎng)后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。各組材料表面培養(yǎng)的細胞使用4%多聚甲醛固定15分鐘,使用1%曲拉通,透膜5分鐘,PBS洗三次后,用鬼筆環(huán)肽在避光條件下染色15分鐘,使用DAPI細胞核染色5分鐘。在暗室使用熒光顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)。7.細胞內(nèi)活性氧檢測通過給各組細胞預(yù)先載入DCDHF-DA熒光探針,熒光酶標儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平。使用24孔板,細胞接種于不同材料表面,方法如上。用10umol/L DCDHF-DA溶液孵育30分鐘,無血清DMEM培養(yǎng)基清洗三次后加入含0,0.1,0.2mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1小時。使用熒光酶標儀在激發(fā)光488nm,發(fā)射光525nm的條件下檢測熒光強度。8.還原型谷胱甘肽檢測使用24孔板,細胞接種于不同材料表面,方法如上。經(jīng)過兩天培養(yǎng)后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時。分別收集各孔細胞,PBS洗兩次,細胞經(jīng)超聲勻漿裂解,4℃條件下高速離心機12,000g離心15分鐘。收集離心后的上清液,使用BCA法檢測蛋白濃度,按照試劑盒的說明檢測細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽總量。9.超氧化物歧化酶檢測使用24孔板,細胞接種于不同材料表面,方法如上。經(jīng)過兩天培養(yǎng)后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H_2O_2的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時。分別收集各孔細胞,PBS洗兩次,細胞經(jīng)超聲勻漿裂解,4℃條件下高速離心機12,000g離心15分鐘。收集離心后的上清液,使用BCA法檢測蛋白濃度,按照試劑盒的說明檢測細胞內(nèi)超氧化物歧化酶活力。結(jié)果:1.氧化應(yīng)激模型建立隨著雙氧水濃度的升高,細胞活力降低。將0mmol/L H_2O_2組細胞活力設(shè)為100%,0.1mmol/L H_2O_2組細胞活力并未明顯下降,0.2mmol/L H_2O_2組細胞活力接近0mmol/L H_2O_2組細胞活力50%,達到半數(shù)抑制濃度IC50,而0.5mmol/L H_2O_2組細胞活力僅為0mmol/L H_2O_2組細胞活力的0.9%。所以我們選擇濃度為0,0.1,0.2mmol/L H_2O_2進行后續(xù)實驗。2.細胞毒性檢測CCK-8法檢測在相同雙氧水濃度條件下,金屬鈮、鈦及聚苯乙烯材料對Ea.hy926細胞的毒性作用,結(jié)果沒有統(tǒng)計學差異(p0.05)。各組材料在0.1mmol/L H_2O_2條件下,細胞活力并未明顯下降,0.2mmol/L H_2O_2組細胞活力接近0mmol/L H_2O_2組細胞活力一半。3.細胞凋亡檢測流式細胞儀細胞凋亡檢測顯示,各組材料表面培養(yǎng)細胞其凋亡率均隨雙氧水濃度升高而提高,在相同雙氧水濃度下,三種材料之間細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異(p0.05)。4.細胞骨架染色各組材料表面培養(yǎng)細胞在0mmol/L H_2O_2條件下均鋪展良好,細胞在0.1mmol/L H_2O_2條件下仍保持了良好的伸展形態(tài),而0.2mmol/L H_2O_2條件下,部分細胞變圓甚至從材料表面分離。三種材料表面培養(yǎng)的細胞,在相同雙氧水濃度條件下,細胞形態(tài)無明顯差異。5.細胞內(nèi)活性氧檢測在相同雙氧水濃度條件下,接種在不同材料表面的細胞,其細胞內(nèi)活性氧強度無明顯差異(p0.05)。相比0mmol/L H_2O_2組,0.1mmol/L H_2O_2組細胞內(nèi)活性氧強度無明顯增強,而0.2mmol/L H_2O_2組細胞內(nèi)活性氧強度幾乎是0mmol/L H_2O_2組兩倍。6.細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽檢測在相同雙氧水濃度條件下,接種在不同材料表面的細胞,其細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽水平無明顯差異(p0.05)。細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽水平均隨雙氧水濃度升高而逐漸降低。7.細胞內(nèi)總超氧化物歧化酶活力檢測在相同雙氧水濃度條件下,接種在不同材料表面細胞,其細胞內(nèi)總超氧化物歧化酶活力無明顯差異(p0.05)。細胞內(nèi)總超氧化物歧化酶活力隨雙氧水濃度升高而逐漸降低。結(jié)論:與金屬鈦和聚苯乙烯相比,金屬鈮在氧化應(yīng)激條件下未對其表面培養(yǎng)Ea.hy926細胞產(chǎn)生的毒性作用。說明金屬鈮在氧化應(yīng)激條件下,具有良好的生物相容性。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 實驗結(jié)果3.1 氧化應(yīng)激模型建立細胞活力隨著雙氧水濃度升高而降低，將 0mmol/L H2O2組細胞活力設(shè)為100%，我們發(fā)現(xiàn) 0.1mmol/L H2O2組細胞活力并未明顯下降，（P>0.05）；0.2mmol/LH2O2組細胞活力接近 0mmol/L H2O2組細胞活力 50%（P<0.05），，達到半數(shù)抑制濃度IC50；而 0.5mmol/L H2O2組細胞活力僅為 0mmol/L H2O2組細胞活力的 0.9（P<0.05）。所以我們選擇 0,0.1,0.2mmol/L 濃度的 H2O2進行后續(xù)實驗。

13圖 3，細胞在不同濃度雙氧水條件下培養(yǎng) 24 小時，流式細胞儀散點圖�？瞻讓φ战M聚苯乙烯 (A-C) , 對照組金屬鈦(D-F) ，實驗組金屬鈮(G-I)。0 mM H2O2組(A,D,G)， 0.1mM H2O2組 (B, E,H)， 0.2mM H2O2組(C, F,I)。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R783.1

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本文編號：2643380