【摘要】：研究背景:骨缺損的修復(fù)是臨床上亟待解決的問(wèn)題之一,現(xiàn)階段骨缺損的治療方法主要有:自體骨移植,異體骨移植以及人工合成替代物移植等。然而自體骨和異體骨移植因來(lái)源和排異反應(yīng)等問(wèn)題,應(yīng)用受到了很大限制。因此人工合成骨替代物一直是組織工程和再生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。骨在體內(nèi)是由成骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的礦化膠原纖維后作為骨的基本結(jié)構(gòu),進(jìn)一步螺旋排布形成復(fù)雜的骨。礦化膠原纖維和成骨細(xì)胞一直是骨再生領(lǐng)域中研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。然而細(xì)胞的體外培養(yǎng)大部分是在二維空間培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞表面與二維培養(yǎng)皿接觸,導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生變化,改變了細(xì)胞干性的表達(dá)。為保存完整的細(xì)胞微環(huán)境,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)是近來(lái)的研究方向之一。體外支架材料如β-TCP以及礦化膠原材料都無(wú)法真實(shí)模擬出骨細(xì)胞的自然分泌形成過(guò)程。因此我們?cè)噲D在體外模擬骨的形成過(guò)程,構(gòu)建出一個(gè)由細(xì)胞和自分泌的礦化細(xì)胞外基質(zhì)作為基本結(jié)構(gòu)的細(xì)胞微球,進(jìn)一步探討所構(gòu)建出微球的性能變化。研究目的:合成具有三維空間結(jié)構(gòu)的細(xì)胞自分泌及組裝的細(xì)胞微球(Cell Spheroid,CS)。模擬體內(nèi)骨的礦化過(guò)程,在體外對(duì)具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞微球進(jìn)行礦化誘導(dǎo);得到類似于骨基本結(jié)構(gòu),由細(xì)胞自分泌的礦化基質(zhì)和細(xì)胞共同組成的復(fù)合物—礦化細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid,MECS)。探討MECS的成骨能力,以及在骨缺損區(qū)域的修復(fù)效果。探討MECS作為骨再生移植物的優(yōu)勢(shì)與不足。方法:體外通過(guò)三維微孔培養(yǎng)板接種大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后通過(guò)將Ca~(2+)、PO_4~(3-)離子的加入,獲得細(xì)胞微球(Cell Spheroid,CS)、礦化細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid,MECS)。體外通過(guò)掃描電鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)對(duì)微球的形貌、成分、力學(xué)性能進(jìn)行分析。Live/dead assay(活/死細(xì)胞檢測(cè))進(jìn)行微球中細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。激光共聚焦顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞微絲骨架(F-actin)、細(xì)胞核(DAPI)以及細(xì)胞分布。體外通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)CS與MECS細(xì)胞中成骨相關(guān)基因ALP、BMP-2的表達(dá)差異;體內(nèi)移植后應(yīng)用Micro-CT,組織學(xué)染色來(lái)觀察CS和MECS是否在骨再生領(lǐng)域有良好的應(yīng)用,是否擁有組織工程再生材料的三大特性:骨引導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和成骨性。結(jié)果:在研究中,我們成功合成CS和MECS兩種細(xì)胞微球,經(jīng)檢測(cè),MECS細(xì)胞外基質(zhì)中有納米羥基磷灰石的分布,其力學(xué)性能遠(yuǎn)優(yōu)于CS,細(xì)胞含量以及直徑尺寸上也優(yōu)于CS。通過(guò)體外PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)MECS的成骨相關(guān)基因ALP、BMP-2的表達(dá)量較CS增高,在裸鼠實(shí)驗(yàn)中,也與體外PCR檢測(cè)相一致,MECS的體內(nèi)有骨樣結(jié)構(gòu)生成。在骨缺損區(qū)域修復(fù)的應(yīng)用中,Micro-CT顯示:骨缺損區(qū)域已由MECS的新生骨填滿,從組織學(xué)染色分析,MECS新生骨區(qū)域包含成熟骨組織以及豐富的血管結(jié)構(gòu)。結(jié)論:1.成功在體外通過(guò)自組裝的形式合成具有三維礦化細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞微球。2.細(xì)胞外基質(zhì)中的納米羥基磷灰石提高了細(xì)胞微球的強(qiáng)度和支撐能力,有利于細(xì)胞的增殖和分化。3.在體內(nèi)和體外,MECS都展現(xiàn)出良好的成骨能力以及血管化能力和骨再生、修復(fù)效果。為組織工程和骨再生提供了一個(gè)新的思路。
【圖文】：

7圖1 骨的九層結(jié)構(gòu)基質(zhì)囊泡中的堿性磷酸酶切割磷酸酯并作為鈣和磷酸鹽沉積的焦點(diǎn)，這一過(guò)程有量的非膠原蛋白（NCP）參與[104-106]。無(wú)機(jī)和有機(jī)相的納米級(jí)精確排列形成了一個(gè)適應(yīng)性強(qiáng)的功能性生物材料。像許多礦化組織一樣，從納米結(jié)構(gòu)到宏觀，，骨由各種形變和韌化機(jī)制增強(qiáng)其抗斷裂能力[107]。作為肌肉-骨骼運(yùn)動(dòng)的主要機(jī)械支持物，骨骼在整個(gè)生命周期中的有效重塑，有利于維持哺乳動(dòng)物機(jī)體骨骼組織的完整性。天然骨主要組成結(jié)構(gòu)從納米到宏觀分為幾個(gè)層次[100]，皮質(zhì)骨和骨小梁的外部幾何形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)代表了骨的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)水平。皮質(zhì)骨包括哈弗斯小管和細(xì)胞。膠原蛋白和羥基磷灰石礦化物作為礦化膠原纖維的主要成分，進(jìn)一步通過(guò)空間結(jié)構(gòu)的組裝形成纖維， 為天然骨骼提供卓越的機(jī)械性能和重塑能力。Weiner和Wagner首先提出了層狀骨組織中的7個(gè)層次[108]�？紤]到有序和無(wú)序成分的存在

基和礦化培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng) 5d。5) 顯微鏡下觀察細(xì)胞球生長(zhǎng)情況。圖1.1 微孔細(xì)胞培養(yǎng)板示意圖表 1.2 礦化 A 液培養(yǎng)基成分 終濃度 品牌α-MEM 培養(yǎng)基 GIBCO胎牛血清 20% GIBCO青霉素/鏈霉素 100U/ml BIOSOURCE谷氨酰胺 2mM BIOSOURCE2-甲氧基雌二醇 55uM GIBCO地塞米松磷酸鈉 55 μM SigmaK2HPO44.2mM 北京化學(xué)試劑廠
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2639354