【摘要】：盡管細(xì)胞生物學(xué)的知識一直在更新進(jìn)步,但人們對細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)和功能仍未完全了解,即便是自然界中最簡單的活細(xì)胞,其結(jié)構(gòu)和功能也極為復(fù)雜,而人造細(xì)胞的出現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的探索指引了新的方向。在過去的幾十年里,人造細(xì)胞的研究在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、超分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域取得了令人矚目的成就。由于磷脂組裝體與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的相似性,聚合物載體本身的機(jī)械穩(wěn)定性、化學(xué)多功能性和可生物降解性,將磷脂組裝體和聚合物載體作為人造細(xì)胞模型在仿生領(lǐng)域的研究已日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。然而目前人造細(xì)胞的構(gòu)建方法在很多方面還不夠完善,與真實(shí)的生物細(xì)胞相比,人造細(xì)胞還過于簡單,無法對復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行模擬。另外,目前也鮮有研究細(xì)胞器之間相互作用的報(bào)道,且生理環(huán)境下人造細(xì)胞的應(yīng)用和人造細(xì)胞與生物細(xì)胞的相互作用也有待探索。因此,針對這些問題,本文通過不同的方式構(gòu)建了人造細(xì)胞并開展了系統(tǒng)的研究。以細(xì)胞膜的基本組分1,2-二油�；字Ｄ憠A(DOPC)為原料,利用點(diǎn)面電極產(chǎn)生的非均勻電場同時制備磷脂微管和巨型磷脂囊泡(giant unilamellar vesicle,GUV)。利用COMSOL軟件分析了產(chǎn)生這種現(xiàn)象的潛在原因,電場產(chǎn)生的臨界力Fc和流體場的側(cè)向流動引起的牽引力F起主要作用,當(dāng)Fc小于F時,形成磷脂微管;當(dāng)Fc大于F時,則形成GUV。另外還從理論模擬上研究了電極間距對生成GUV和磷脂微管比率(GT ratio)的影響,并用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示電極間距越大,生成磷脂囊泡的比率越大。結(jié)合微接觸剝離技術(shù)和電形成方法,利用點(diǎn)面電極與聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)印章可制備出附著于基底的GUV陣列。GUV的尺寸與剝離步驟所用的PDMS印章特征尺寸相近,通過PDMS印章的尺寸可以控制GUV陣列的尺寸,20、50和85μm的印章制備出的GUV直徑分別為27.87±2.22μm、64.06±3.08μm和82.25±5.76μm。不同種類的單元磷脂或三元混合磷脂都可以制備GUV陣列,其中DOPC GUV陣列效果最好,可作為細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)研究。GUV陣列可作為封裝DNA等生物分子、研究物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸和模擬細(xì)胞代謝的良好平臺。GUV內(nèi)羧基熒光素CF的擴(kuò)散程度受蜂毒素濃度的影響,當(dāng)蜂毒素濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μM時,CF的擴(kuò)散系數(shù)(D)分別為0.37×10~(-11)、0.36×10~(-11)、0.54×10~(-11)、1.10×10~(-11)、1.74×10~(-11)、2.31×10~(-11)、3.62×10~(-11) m~2/s。將辣根過氧化物酶(HRP)負(fù)載于GUV陣列中被用于模擬細(xì)胞代謝,底物H_2O_2和o-PD成功地?cái)U(kuò)散至GUV內(nèi)部發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生了熒光物質(zhì)2,3-二氨基吩嗪(2,3-DAP)。受真核細(xì)胞區(qū)室化結(jié)構(gòu)啟發(fā),基于海藻酸鹽構(gòu)建了同時含有載酶脂質(zhì)體(L_(Cat))和真實(shí)細(xì)胞核(pNuc)的多室人造細(xì)胞,其中pNuc來源于RAW 264.7細(xì)胞,可合成mRNA,而L_(Cat)可模擬細(xì)胞器,能夠?qū)⑦^氧化氫(H_2O_2)轉(zhuǎn)化為氧氣和水。與不存在H_2O_2或不含L_(Cat)的人造細(xì)胞相比,含有天然pNuc和合成L_(Cat)的人造細(xì)胞在H_2O_2存在下可產(chǎn)生更多的mRNA,說明局部酶反應(yīng)產(chǎn)生的O_2可促進(jìn)mRNA的合成。這種含有天然和人工細(xì)胞器的新型人造細(xì)胞的設(shè)計(jì)為缺氧細(xì)胞模型的制備或無細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成提供了機(jī)會。利用微接觸印刷(μCP)技術(shù)制備了P1粒子陣列,評價(jià)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和HepG2肝癌細(xì)胞在圖案化基底上的黏附和增殖行為。HUVEC細(xì)胞在P1粒子陣列上的黏附取決于P1附著于基底的穩(wěn)定性,若P1附著于基底的穩(wěn)定性較弱,則HUVEC會取代P1黏附在整個基底并發(fā)生增殖,若P1附著于基底的穩(wěn)定性足夠強(qiáng),細(xì)胞在無粒子存在的區(qū)域黏附;而HepG2肝癌細(xì)胞在P1陣列上沒有空間選擇性,48 h內(nèi)細(xì)胞在此圖案化基底上均勻黏附和增殖且不會破壞粒子陣列。利用層層組裝技術(shù),用聚合物涂層把葡萄糖氧化酶負(fù)載的脂質(zhì)體(L_(GOx))固定到SiO_2粒子上,構(gòu)建出復(fù)雜的多室人造細(xì)胞,同樣應(yīng)用μCP技術(shù)制備人造細(xì)胞陣列,溶液中和陣列上人造細(xì)胞的活性直接取決于制備過程中組裝L_(GOx)的用量。最后,將載酶人造細(xì)胞陣列與HepG2肝癌細(xì)胞共培養(yǎng),由于在底物葡萄糖存在的情況下,局部產(chǎn)生的H_2O_2可殺死肝癌細(xì)胞,因此與在無酶陣列中黏附的細(xì)胞相比,載酶人造細(xì)胞陣列作用下的HepG2肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞死亡率。該結(jié)果對復(fù)雜多室人造細(xì)胞的設(shè)計(jì)與構(gòu)建提供了重要指導(dǎo),在細(xì)胞治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

圖 1-1 Robert Hooke 自制的簡陋顯微鏡及觀察到的細(xì)胞[6]ig. 1-1 Discovery of cell using home-made microscope by Robert Hook對生命體的組成具有重要意義。原始細(xì)胞經(jīng)歷億萬年來的進(jìn)功能上如此復(fù)雜而完美的現(xiàn)代細(xì)胞，但原始細(xì)胞從何而來，決這些長期存在的謎團(tuán)具有深遠(yuǎn)的意義。即使對生命起源的也將有助于彌合非生命和生命形式物質(zhì)之間的溝壑，有助于論的統(tǒng)一。所述，盡管細(xì)胞生物學(xué)的知識一直在更新進(jìn)步，但人們對細(xì)能仍未完全了解，即便是最簡單的活細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和功能也極降低活細(xì)胞的復(fù)雜性并克服活細(xì)胞脆弱性的問題，科學(xué)家們系中研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性、細(xì)胞的動態(tài)活動、細(xì)胞間生命的起源，因此穩(wěn)定且易控制的人造細(xì)胞的構(gòu)建十分必要 年，Chang 等人首次提出了人造細(xì)胞的概念[13, 14]，并引起學(xué)20 世紀(jì) 70 年代，研究人員將酶、蛋白質(zhì)和激素引入可生物并用于 Lesch-Nyhan 綜合征等疾病的治療中[15, 16]。20 世紀(jì)[17, 18]

圖 1-2 人造細(xì)胞的基本組成和尺寸[37]Fig. 1-2 Basic compositions and dimensions of artificial cells[37細(xì)胞的構(gòu)建胞的構(gòu)建是合成生物學(xué)的支柱之一[38]。理想的典型人造似的結(jié)構(gòu)或表現(xiàn)出一些生物細(xì)胞的基本特性[39-41]，，構(gòu)建“活著”的人造細(xì)胞[32]。一般來說，“活著”就意味著復(fù)制和自我更新。活細(xì)胞本身在結(jié)構(gòu)和功能上的復(fù)雜性胞的構(gòu)建變得極為艱巨且極具挑戰(zhàn)性。生物細(xì)胞具有三的基本功能[1]：（i）穩(wěn)定的半透膜，包裹細(xì)胞成分，維內(nèi)物質(zhì)免受胞外環(huán)境的破壞，同時又能調(diào)節(jié)物質(zhì)選擇傳信息生物大分子（DNA 或 RNA），控制細(xì)胞的動態(tài)與進(jìn)化的能力；（iii）一系列代謝途徑，為細(xì)胞提供能量持自我更新�？茖W(xué)家們非常希望人造細(xì)胞具有生物細(xì)胞- 5 -
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 穆筱梅;梁世強(qiáng);;脂質(zhì)體的制備方法及其研究進(jìn)展[J];時珍國醫(yī)國藥;2008年07期

2 何淑蘭,尹玉姬,張敏,姚康德;組織工程用海藻酸鹽水凝膠的研究進(jìn)展[J];化工進(jìn)展;2004年11期

3 劉朝暉,王棟;脂質(zhì)體技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2004年02期

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本文編號：2638578