【摘要】：由于耐藥性細(xì)菌在世界范圍內(nèi)的廣泛播散,傳統(tǒng)類型的抗生素已經(jīng)不能很好地應(yīng)對(duì)因耐藥菌感染而導(dǎo)致的公共健康威脅。在這種條件下,納米材料作為一種新興的抗菌物質(zhì)進(jìn)入了人們的視野。納米顆粒的優(yōu)勢(shì)一方面在于可以通過某些特殊的靶向機(jī)制向感染部位富集,并發(fā)揮一個(gè)類似于“藥物儲(chǔ)庫(kù)”的作用,在實(shí)現(xiàn)局部高濃度給藥的同時(shí),避免對(duì)周圍正常組織的毒害。另一方面,由于納米顆粒的抗菌性能主要是基于與細(xì)菌細(xì)胞壁的直接接觸,而不需要穿透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),因此不容易導(dǎo)致細(xì)菌的交叉耐藥性。此外,由金屬納米顆粒釋放的離子以及某些金屬介導(dǎo)的光熱效應(yīng)也可以發(fā)揮殺菌作用。然而,當(dāng)實(shí)際應(yīng)用于臨床時(shí),納米顆粒的抗菌效果經(jīng)常會(huì)受到多方面的影響。一方面,在體內(nèi)形成的混合生物膜感染往往是多種細(xì)菌共同作用的結(jié)果,而非在實(shí)驗(yàn)室條件下的單一培養(yǎng)物。另一方面,在體內(nèi)的復(fù)雜條件下,納米顆粒容易因吸附蛋白質(zhì)等生物大分子而發(fā)生團(tuán)聚。由此造成的有效濃度下降會(huì)誘發(fā)抗性基因的形成并最終導(dǎo)致治療失敗。此外,由于在體內(nèi)形成的細(xì)菌感染主要發(fā)生在胞內(nèi)環(huán)境中并受到宿主免疫應(yīng)答的影響,在這種條件下,細(xì)菌的生長(zhǎng)速率較為緩慢,且存在著大量處于生長(zhǎng)停滯階段的休眠菌,因此對(duì)外界的應(yīng)激條件產(chǎn)生了明顯的耐受性。在本論文中,我們選用經(jīng)典的銀納米顆粒(AgNPs)作為一種廣譜性的抗菌性納米材料,并測(cè)試了其在不同濃度下(尤其是非致死性濃度)對(duì)菌膜形成以及細(xì)菌代謝水平的影響。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果概述如下:(1)AgNPs對(duì)菌膜生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響。我們基于經(jīng)典的銀氨溶液法合成了水相AgNPs,并測(cè)得其對(duì)游離銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)為2μg/mL。然而,在菌膜生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)在MIC濃度下生長(zhǎng)的菌膜,其達(dá)到成熟階段時(shí)的最大菌膜量與對(duì)照組相比不存在顯著性差異,僅僅是在生長(zhǎng)周期上發(fā)生了2個(gè)小時(shí)的滯后。一系列濃度梯度實(shí)驗(yàn)顯示,雖然隨著AgNPs濃度的增加,其菌膜的總生物量也隨之下降,但是滯后期的存在以及一段時(shí)間后的恢復(fù)生長(zhǎng)仍舊說明了細(xì)菌耐受性機(jī)制以及抗藥性突變的存在。(2)AgNPs對(duì)菌膜形貌及EPS分泌效率的影響。通過對(duì)不同暴露條件下成熟菌膜的共聚焦熒光圖像進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)雖然高濃度的AgNPs能夠廣泛抑制生物膜內(nèi)細(xì)菌的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(EPS)的分泌,但是當(dāng)AgNPs濃度為2μg/mL或6μg/mL時(shí),其成熟菌膜中總生物量的下降主要是由于菌膜內(nèi)活細(xì)胞數(shù)目的減少,而EPS分泌量則不存在顯著性差異。特別是當(dāng)環(huán)境中的AgNPs濃度為2μg/mL時(shí),成熟菌膜中EPS的分泌量甚至略高于對(duì)照組。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明低劑量的AgNPs暴露反而能夠促進(jìn)菌膜內(nèi)EPS的代償性分泌。(3)AgNPs對(duì)菌膜內(nèi)組份及抗性基因形成的影響。通過對(duì)菌膜內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)組份的化學(xué)定量,我們進(jìn)一步明確了在不同暴露條件下菌膜內(nèi)的代謝水平變化。當(dāng)AgNPs濃度為2μg/mL時(shí),菌膜內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)的分泌量都高于對(duì)照組,這一點(diǎn)與熒光分析結(jié)果互相印證。另外,平板計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示隨著AgNPs濃度的升高,菌膜內(nèi)的細(xì)胞活力水平呈單調(diào)下降的趨勢(shì),也從另一個(gè)角度說明了當(dāng)細(xì)菌面對(duì)不利的外界條件時(shí),傾向于降低自身的生長(zhǎng)速率并代償性地分泌更多EPS以抵抗外界應(yīng)激條件的沖擊。
【圖文】：

圖 1.1 菌膜的復(fù)雜超細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其功能Figure 1.1 Complex supra-cellular architecture and its function within biofilm單顆粒追蹤技術(shù)結(jié)合微流變學(xué)檢測(cè)顯示，該大腸桿菌生物膜的電荷密度與時(shí)間變化呈高度依賴性[16]。由于 EPS 分子填充于生物膜細(xì)菌之間的間隙，因此 EPS分子的性質(zhì)直接決定了生物膜的形態(tài)和細(xì)菌生存條件，并為生物膜提供機(jī)械穩(wěn)定性[17]。生物膜基質(zhì)的主要成分是水（約占 97%），其它組分，例如可溶性凝膠形成多糖、蛋白質(zhì)和 eDNA，以及不溶性成分如淀粉樣蛋白、纖維素、菌毛和鞭毛共同參與維持基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[18]。最近，有研究證明，在 EPS 基質(zhì)內(nèi)部，微菌落之間形成的孔隙與通道有助于生物膜內(nèi)的液體運(yùn)輸[19,20]，這說明生物膜具有一個(gè)類似于“基本循環(huán)系統(tǒng)”的功能[21]。在某些情況下，基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)組份也可能有利于生物膜應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化。例如，，在大腸桿菌形成的生物膜中，基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成分卷曲蛋白，與纖維素一起增強(qiáng)了生物膜對(duì)干燥的耐受性�？莶菅挎�

圖 1.2 生物膜內(nèi)不同細(xì)菌種群間的信號(hào)傳導(dǎo)與協(xié)作Figure 1.2 Social interactions within biofilms1.2.2 生物膜的流變學(xué)特性及其動(dòng)態(tài)過程雖然機(jī)械穩(wěn)定性對(duì)生物膜的存在至關(guān)重要，但生物膜本身并非剛性結(jié)構(gòu)，而是一種非常粘稠的流體。位于生物膜中的細(xì)菌細(xì)胞可以在基質(zhì)中移動(dòng)，從而對(duì)生物膜的多孔性、機(jī)械強(qiáng)度和微流變學(xué)性能造成影響[17]。例如在高鹽條件下的微生物組織中，經(jīng)常能觀察到細(xì)菌種群的垂直遷移以及不同細(xì)菌種群間的分工協(xié)作[25]。最近的觀察表明，活動(dòng)的浮游蘇云金芽孢桿菌亞群能夠以高速（20μm·sec-1）深入到生物膜結(jié)構(gòu)中。穿過生物膜的浮游細(xì)菌會(huì)在生物膜基質(zhì)間形成短暫的空隙，從而促進(jìn)生物膜中物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。也有其它的證據(jù)表明基質(zhì)的部分降解可以導(dǎo)致生物膜的主動(dòng)分散。我們通過這些觀察結(jié)果得到一個(gè)共同結(jié)論：在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間尺度上，細(xì)菌在自發(fā)形成高度有序的生物膜基質(zhì)之后，還會(huì)再經(jīng)歷周期性的離散
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TB383.1;R318.08

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本文編號(hào)：2593007