【摘要】：研究背景及目的骨質(zhì)缺損是臨床治療的難點(diǎn),目前迫切需要研究新型的人工骨替代材料。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示α半水硫酸鈣/納米羥基磷灰石(α-CSH/n-HA)復(fù)合材料具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性,但骨誘導(dǎo)性能較弱。因此,本課題創(chuàng)新性地將骨誘導(dǎo)性能良好的槲皮素(Quercetin)與α-CSH/n-HA復(fù)合,以期得到一種性能更為理想的新型材料。研究方法1.材料的制備與性能檢測(cè)機(jī)械混合法制備Q-α-CSH/n-HA。X-ray衍射實(shí)驗(yàn)(XRD)、傅里葉紅外掃描(FTIR)、掃描電鏡(SEM)、壓強(qiáng)實(shí)驗(yàn)及X-ray能譜分析(EDX)分別檢測(cè)材料的晶體結(jié)構(gòu)、表面特征、機(jī)械強(qiáng)度及元素構(gòu)成;體外降解實(shí)驗(yàn)及Ca2+與Quercetin濃度測(cè)定。2.BMSCs細(xì)胞實(shí)驗(yàn)制備材料浸提液并檢測(cè)Ca2+與Quercetin濃度;MTT法、CCK-8法及劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞毒性、增殖情況及遷移能力;qRT-PCR檢測(cè)成骨分化基因表達(dá);茜素紅及von kossa染色檢測(cè)成骨礦化能力。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分別建立年輕與年老兩批SD大鼠脛骨臨界性骨缺損模型并植入Q-α-CSH/n-HA(0%、0.5%、1.5%和3%)。X-ray和micro-CT檢測(cè)骨缺損修復(fù)和新骨形成;HE、Goldner及Safranin O染色觀察新骨生成及材料降解情況;免疫熒光法觀察RUNX2/OSX/OCN陽性細(xì)胞數(shù);CFU法檢測(cè)克隆集落形成能力;測(cè)定大鼠血清Ca2+濃度。研究結(jié)果1.XRD、FTIR及EDX結(jié)果顯示Q-α-CSH/n-HA的衍射光譜、紅外光譜及元素構(gòu)成與α-CSH/n-HA類似,但降解后的材料元素構(gòu)成更復(fù)雜;SEM顯示Quercetin的加入增加了材料的微球數(shù)目,降解后孔隙率明顯增加;Quercetin的加入導(dǎo)致材料機(jī)械強(qiáng)度遞減,但仍高于正常人體松質(zhì)骨水平;Quercetin對(duì)復(fù)合材料的降解速度及降解液中Ca2+水平無明顯影響,但Quercetin濃度遞增。2.隨著Quercetin 比重的增加,浸提液中Ca2+濃度無差異,Quercetin濃度遞增,大鼠BMSCs增殖率增加,遷移能力增強(qiáng),TNF-α表達(dá)下調(diào),OSX/RUNX2/OCN/ALP/BMP-2/OPN/BSP/Smad2/TGF-β表達(dá)上調(diào),成骨分化及礦化能力增強(qiáng),其中1.5%Q組效果最明顯;所有實(shí)驗(yàn)組均無細(xì)胞毒性。3.X-ray和Micro-CT結(jié)果顯示含Quercetin的材料組骨缺損的修復(fù)速度和新生骨的形成均較對(duì)照組明顯增加;病理染色結(jié)果顯示Quercetin能明顯促進(jìn)新生骨質(zhì)、血管的生成和材料降解吸收;免疫熒光法觀察到Quercetin能明顯增加RUNX2/OSX/OCN陽性細(xì)胞數(shù);以上效應(yīng)在年輕大鼠中1.5%Q組最好,年老大鼠中3%Q組最好。血清Ca2+濃度只有年輕大鼠1.5%Q組明顯高于對(duì)照組;CFU法結(jié)果顯示年輕大鼠1.5%Q組與年老大鼠3%Q組均明顯優(yōu)于對(duì)照組。主要結(jié)論1.Quercetin能明顯增加復(fù)合材料表面微球結(jié)構(gòu)、降解后孔隙率及藥物釋放量,對(duì)材料的理化性質(zhì)無明顯負(fù)面影響。2.體外實(shí)驗(yàn):Q-α-CSH/n-HA具有良好的生物安全性;Quercetin能有效增強(qiáng)BMSCs的增殖、遷移、成骨分化及礦化成熟能力,具有理想的骨誘導(dǎo)性。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):Q-α-CSH/n-HA在體內(nèi)生物降解后所形成的多孔腔隙結(jié)構(gòu)更有利于骨質(zhì)缺損的修復(fù)和n-HA的重吸收,更具整體修復(fù)效果。Quercetin、Ca2+的釋放可能協(xié)同作用改變了造模區(qū)域的微環(huán)境,同時(shí)Quercetin的抗衰老效應(yīng)與骨誘導(dǎo)效應(yīng)也可能協(xié)同作用,共同促進(jìn)了大鼠BMSCs的增殖、遷移、募集及成骨分化;Q-α-CSH/n-HA的降解、吸收、機(jī)化、血管長(zhǎng)入,成骨細(xì)胞的礦化成熟以及新生骨質(zhì)的形成之間可能保持動(dòng)態(tài)平衡,并最終促進(jìn)了骨質(zhì)缺損的修復(fù)重建。
【圖文】：

逑Ｗ１邋Ｗ２邋Ｗ３邋Ｗ４邋Ｗ５邐Ｗ６邋Ｗ７邋Ｗ８逡逑圖１－７不同含槲皮素濃度復(fù)合材料的體外降解曲線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－７邋Ｔｈｅ邋ｖｉｔｒｏ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ邋ｃｏｎｔｅｎｔ．逡逑２．７體外降解液中鈣離子、槲皮素濃度測(cè)定逡逑不同含槲皮素濃度的復(fù)合材料體外降解液中的鈣離子與槲皮素含量變化如逡逑圖１－８所示。第一周，ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ組和０．５％Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ組降解液中的Ｃａ２＋逡逑濃度較１．５％及３％復(fù)合材料組中的Ｃａ２＋濃度偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．0５），逡逑前者兩組間比較差異無意義，后者兩組間比較同樣無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而后，時(shí)逡逑間進(jìn)入第二周直至第八周，四個(gè)濃度組的復(fù)合材料體外降解液中鈣離子濃度差逡逑異不大。所有實(shí)驗(yàn)組，，第二周至第四周，鈣離子濃度曲線下降明顯；第五周開始逡逑鈣離子濃度趨于穩(wěn)定，進(jìn)入平臺(tái)期，而四組材料的鈣離子濃度曲線也基本呈現(xiàn)重逡逑１９逡逑

ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ邋組介于中間；而邋７２ｈ邋時(shí)，０．５％Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ邋組組最低，ａ－ＣＳＨ／ｎ－逡逑ＨＡ和３％Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ組介于中間，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組間比較，差異均沒有明顯統(tǒng)逡逑計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0．0５，詳見表２－６和圖２－２所示）。不同濃度Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ復(fù)合逡逑材料浸提液對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ＢＭＳＣｓ）的細(xì)胞毒性均為Ｉ級(jí)，即無細(xì)逡逑胞毒性。逡逑４１逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R318.08;R68

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本文編號(hào)：2592395