【摘要】：骨缺損的修復是骨修復醫(yī)學領(lǐng)域所面臨的難題,而骨組織工程發(fā)展為骨缺損的修復提供了新的研究方向。醫(yī)用鈦金屬材料具有良好的機械性能和生物相容性,因此,以其作為骨組織工程支架材料的相關(guān)研究得到廣泛的報道。但是,鈦金屬材料表面不具有生物學活性,容易導致受體骨組織從植入的鈦金屬材料表面脫落。所以,探索如何提高鈦金屬材料表面的生物學活性成為該領(lǐng)域亟待解決的科學問題。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是骨形成和發(fā)生過程中重要的調(diào)控因子,并且能夠誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細胞方向分化,進而被廣泛的用于提高骨組織工程支架材料表面的生物學活性。有研究發(fā)現(xiàn),3,4-L-二羥基苯丙氨酸(3,4-L-dihydroxyphenylalanine,DOPA)能夠粘附在Au、Ag、Ti O2等多種金屬材料表面。因此,以DOPA作為媒介,將BMP-2固定到鈦金屬材料表面,對于提高鈦金屬材料表面的生物學活性具有重要意義。本課題通過基因工程的方法將酪氨酸重復序列(Tyrosine-lysine-tyrosinelysine-tyrosine,YKYKY)整合到BMP-2的基因序列末端,并利用大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)將其進行表達;利用快速蛋白液相色譜(Fast protein liquid chromatography,FPLC)將大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)進行純化,然后,通過酪氨酸羥化反應(yīng)完成DOPA的轉(zhuǎn)化;通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和免疫印跡等方法對蛋白質(zhì)的大小、純度和特異性進行鑒定;利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)確定YKYKY中的酪氨酸是否被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)镈OPA;通過圓二色光譜法(Circular dichroism spectrum,CDS)和ELISA法對蛋白質(zhì)的生物學活性進行分析和檢測;通過掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)、能譜儀(Energy dispersive spectrometer,EDS)和耗散型石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)對固化后材料的表面、碳元素特征峰和生長因子含量的改變進行分析;利用小鼠成肌細胞和人骨髓間充質(zhì)干細胞與固化的鈦金屬材料共培養(yǎng)實驗,測定經(jīng)過固化后鈦金屬材料成骨誘導能力的改變;最后,通過體內(nèi)實驗進一步確定固化的鈦金屬材料表面鈣元素的累積情況。實驗結(jié)果表明:所構(gòu)建的BMP-2-YKYKY質(zhì)粒能夠在E.coli中表達,且所獲得的目標蛋白質(zhì)經(jīng)過純化后具有較高純度,進一步通過分子量和特異性的鑒定,確定所獲得的目標蛋白質(zhì)為BMP-2-YKYKY;經(jīng)過羥化反應(yīng)后,BMP-2-YKYKY中的3個酪氨酸均被羥化成為DOPA,同時,羥化后的蛋白質(zhì)溶液仍然具有較高的純度;通過生物學活性鑒定,發(fā)現(xiàn)YKYKY和DOPA的加入并沒有對BMP-2的生物活性功能區(qū)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響;并且,經(jīng)過修飾的BMP-2不僅生物學活性幾乎沒有變化,而且具備了DOPA的粘附能力(在p H=8.5時,粘附能力最強);BMP-2-XKXKX能夠顯著改變鈦金屬材料表面的粗糙程度,提高BMP-2在鈦金屬材料表面的粘附量(表面的生長因子含量達到631.43ng/cm2);經(jīng)過BMP-2-XKXKX修飾后的鈦金屬材料具有較強的成骨誘導能力,不僅能夠顯著促進小鼠成肌細胞(C2C12-BRE-Luc)內(nèi)雙熒光素酶(DualLuciferase)的表達,而且可以顯著促進人骨髓間充質(zhì)細胞內(nèi)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和成骨相關(guān)基因RUNX2、OSTERIX和ALP的表達,抑制干性基因OCT4、NANOG和SOX2的表達;進一步的體內(nèi)實驗表明,經(jīng)過BMP-2-XKXKX固化的鈦金屬材料能夠促進鈣元素在材料表面積累。綜上所述,本課題以DOPA作為媒介,將BMP-2固定到鈦金屬材料表面,探索固化后鈦金屬材料表面的生物學活性改變。結(jié)果提示,DOPA的引入不僅能夠保持BMP-2的生物學活性,而且可以促進BMP-2在鈦金屬表面的粘附,提高鈦金屬材料表面的生物學活性,增強鈦金屬材料的成骨誘導能力,為鈦金屬材料的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 骨重塑模擬圖引自：http://www.sierrasil.com/connect/news/studies/the-role-of-minerals-in-joint-health/雖然骨表現(xiàn)出的性質(zhì)是固體和剛性,但它實際上是一個新陳代謝活躍的組織。在成年人的骨骼,骨重塑的過程包括大多數(shù)骨代謝活動發(fā)生,這對維持骨骼結(jié)構(gòu)和鈣穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。圖 1.1 說明了骨重塑的過程，骨重塑一般有三個時期，即骨吸收期、骨逆轉(zhuǎn)期和骨形成期。涉及到破骨細胞的脫骨化和脫鈣化,其次未礦化的成骨細胞的形成,最終變成了礦化。骨重塑周期由三個階段組成: ①骨吸收期,此時破骨細胞消化表面殘留的老化骨；②骨逆轉(zhuǎn)期,這時單個核細胞出現(xiàn)在骨表面；③骨形成期,成骨細胞形成與礦質(zhì)化�？梢园l(fā)現(xiàn)成骨細胞是骨組織工程最為關(guān)鍵的細胞，成骨細胞在骨基質(zhì)礦質(zhì)化過程中逐漸被包被在骨陷窩中，從而成為骨細胞。成骨細胞作為重要的種子細胞，主要來源有骨膜、骨髓和骨外組織[5]。

圖 1.2 組織工程應(yīng)用的干細胞及其分化圖ESC: Embryonic stem cell，胚胎干細胞; NSC: Neuronal stem cell，神經(jīng)干細胞;EpSC: Epidermal stem cell，表皮干細胞; MSC: Mesenchymal stem cell，，間充質(zhì)干細胞; HSC: Haematopoeitic stem cell，造血干細胞。引自：http://www.york.ac.uk/res/bonefromblood/background/MSC%20diff%20best.jpg在適宜的誘導條件下，間充質(zhì)干細胞能夠較為容易地分化為軟骨、成骨、成肌、基質(zhì)和脂肪細胞等不同種類的細胞（圖 1.3）。骨髓間充質(zhì)干細胞由于其分離較容易且不涉及倫理和來源問題逐漸成為骨組織工程中使用最廣泛的種子細胞之一。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R68

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李娟;戴文達;董健;;骨組織工程研究進展[J];中國骨傷;2008年11期

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 陶鳳娟;純鈦表面塑性變形納米化對MC3T3細胞生物學行為的影響[D];復旦大學;2009年

2 何嬋;Ti-N/Ti-O復合薄膜人工心臟瓣膜表面改性[D];西南交通大學;2009年

本文編號：2587075