【摘要】：組織修復材料的降解速率難以與體內(nèi)組織的再生速率相匹配是生物材料面臨的瓶頸問題。采用常用的改性方法,雖然可以通過分子設計調(diào)節(jié)材料的降解速率,但對于同一種材料,其降解時間相對固定,無法適應體內(nèi)復雜多變的修復情況。由此引發(fā)一系列問題,有的材料降解速度過快,導致新生組織的生長、爬移失去必要的附著體,無法實現(xiàn)缺損的完整修復；有的則降解速度太慢或幾乎不降解,使得新生組織的生長受到阻擋和抑制,同樣導致修復效果不理想。 設計具有響應特性的生物材料,借助體內(nèi)微環(huán)境的變化作為觸發(fā)開關(guān),改變材料本身的性能,引起材料結(jié)構(gòu)發(fā)生斷鏈,導致降解發(fā)生并調(diào)控降解速率成為構(gòu)建響應性降解材料的新思路,有望實現(xiàn)材料與機體組織生長速度相匹配,達到自適應性降解。 本論文從生物響應性降解角度出發(fā),設計具有氧化還原響應性的四臂聚乙二醇基水凝膠體系,考察這一體系材料的理化性能、生物相容性、尤其是生物可降解性能；同時以其為載體,與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)復合,制備用于骨組織修復的響應性凝膠體系�；谝陨纤悸�,本文開展了以下工作： (1)四臂聚乙二醇基PEG-TA水凝膠的合成與表征 以四臂聚乙二醇為基體,通過兩步法制得凝膠前驅(qū)物聚乙二醇硫代乙酸酯醚PEG-TA,并對其結(jié)構(gòu)進行表征。在堿性條件下PEG-TA水解生成具有活性的硫負離子,經(jīng)H202氧化形成以二硫鍵交聯(lián)的水凝膠體系。考察了PEG-TA質(zhì)量分數(shù)、H202濃度和用量、pH值和溫度對凝膠化時間、凝膠含量和含水量、流變學、親水性等性能的影響,凝膠化時間從15s到6min可調(diào)。同時,二硫鍵交聯(lián)凝膠可對還原作用產(chǎn)生響應,切斷凝膠網(wǎng)絡中的二硫鍵從而發(fā)生降解。著重考察了凝膠在模擬人體細胞外基質(zhì)濃度水平的谷胱甘肽(GSH,0.01mM)溶液中的響應性降解行為,降解時間為4d至75d。MTT法考察凝膠及其產(chǎn)物的細胞毒性,結(jié)果顯示產(chǎn)物無毒,細胞毒性等級為1級。研究表明,PEG-TA水凝膠的形成和降解可通過氧化和還原作用進行調(diào)控,是一種氧化還原響應型水凝膠體系。 (2)四臂聚乙二醇基可注射PEG-SH水凝膠的合成與表征 以PEG-TA和甲醇為原料,通過酯交換反應得到具有活性的巰基化聚乙二醇PEG-SH。在H2O2氧化作用下PEG-SH能夠發(fā)生二硫鍵交聯(lián)形成水凝膠。與PEG-TA相比,反應條件更加溫和,在中性介質(zhì)中即發(fā)生凝膠化,可作為原位注射水凝膠使用。凝膠化時間從14s到26min可調(diào),注射性良好。利用二硫鍵同時具有氧化性和還原性的特點,凝膠對模擬人體細胞外基質(zhì)濃度水平的GSH (0.01mM)和病灶部位濃度水平的H2O2(0.3mM)均能發(fā)生二硫鍵響應性斷鏈降解。在GSH中的降解時間最長達32d,H2O2中最長達70d。以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白考察凝膠的緩釋行為,釋放前期存在突釋效應,釋放中期速率平緩,后期能夠達到完全釋放。MTT法評價PEG-SH可注射凝膠體系的細胞相容性,凝膠及其降解產(chǎn)物與小鼠成肌細胞C2C12共培養(yǎng)實驗表明,材料的細胞毒性等級為1級。 (3)可注射PEG-SH水凝膠的生物降解性及負載rhBMP-2異位誘導成骨 通過細胞簇侵入實驗考察細胞在凝膠中的行為,結(jié)果表明,包覆于凝血酶的細胞簇能夠遷移至凝膠內(nèi)部并完全鋪展。注射于大鼠皮下的凝膠能夠快速發(fā)生相轉(zhuǎn)變,10d可觀察到明顯降解。 將生長因子rhBMP-2與PEG-SH前驅(qū)液混合,制備負載rhBMP-2的可注射凝膠體系。異位成骨實驗顯示成骨量隨時間延長而增加：未負載rhBMP-2凝膠無成骨現(xiàn)象發(fā)生,材料基本降解。成骨與凝膠的降解密切相關(guān),材料在細胞的吞噬作用和骨基質(zhì)包埋作用下降解,使rhBMP-2得以完全釋放,持續(xù)誘導成骨作用；持續(xù)成骨導致更多骨基質(zhì)的分泌,從而加速材料的降解,成骨與降解相互促進。水凝膠的降解為骨細胞和血細胞提供了生長空間和自由的養(yǎng)分傳輸,有利于細胞的增殖、鋪展和遷移,也有利于血管發(fā)生。 (4) PEG-SH凝膠凍干支架的生物降解性及負載rhBMP-2誘導異位成骨 采用冷凍干燥方法將PEG-SH水凝膠制成多孔干凝膠支架。質(zhì)量分數(shù)為3%、5%、10%、15%的干凝膠支架在細胞外濃度水平GSH(0.01mM)中響應性降解時間分別為3d.6d、6d、22d;在細胞內(nèi)濃度水平GSH(3mM)中為0.5h、1h、3h、4h。與水凝膠相比,支架對GSH響應更加靈敏和迅速,溶脹率明顯增加。 負載rhBMP-2凝膠支架異位成骨實驗顯示,成骨量隨時間延長而增加,高于同期注射型水凝膠的異位誘導成骨量;未負載rhBMP-2凝膠無成骨現(xiàn)象發(fā)生,支架材料基本降解。成骨與支架降解密切相關(guān),材料通過紅細胞免疫粘附作用、白細胞吞噬作用、成骨細胞分泌骨基質(zhì)的包埋作用達到逐步降解。降解后期rhBMP-2得以完全釋放,持續(xù)誘導成骨；持續(xù)成骨加速材料降解,成骨與降解相互促進。支架的降解為骨細胞和血細胞提供了生長空間,促進成骨和血管發(fā)生。 (5) PEG-SH凝膠凍干支架負載rhBMP-2修復臨界橈骨缺損 制備生長因子與PEG-SH凍干凝膠支架復合體系,建立兔橈骨15mm節(jié)段骨缺損動物模型,評價自行修復、單純支架修復、載rhBMP-2或RGD多肽復合支架對兔臨界骨缺損的修復效果。 實驗結(jié)果表明因子的誘導作用、支架材料的傳導作用和降解作用等因素均明顯影響修復效果。隨時間由2w延長至12w,各組成骨量逐漸增加,單純支架組成骨量略高于自行修復組,rhBMP-2復合支架組明顯高于單純支架組,而rhBMP-2和RGD多肽同時復合支架組優(yōu)于只加rhBMP-2組。12w新骨生物力學性能測試表明,rhBMP-2復合支架組、rhBMP-2和RGD多肽同時復合材料組最大彎曲載荷分別為232.9N和251.0N,接近正常健康兔骨256.4N的數(shù)值,遠高于空白組和不含BMP組。通過組織學切片分析,自行修復組成骨速度較慢,單純材料組略快,12w內(nèi)兩組均不能使骨髓腔再次連通,且出現(xiàn)骨不連；生長因子復合材料組能夠完成缺損區(qū)域的修復,再造連通骨髓腔。成骨與支架的降解密切相關(guān),相互促進。支架材料對成骨過程中血管發(fā)生起到促進作用,含有支架的三組均比自行修復組顯現(xiàn)出更多血細胞和血管。負載rhBMP-2的PEG-SH凝膠支架可以用作臨界骨缺損的修復。
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：2581203