【摘要】：研究背景：膽道手術是外科手術的難點,術中損傷膽管的修復、修復后發(fā)生再狹窄以及膽道惡性狹窄的治療一直是腹部外科的難題。人們一直在試圖設計一種可以代替膽管結構和功能的人工膽管,來解決膽管修復與重建的難題。同種異體移植已經在臨床工作中廣泛開展,但術后對于排斥反應的預防和治療仍有很多問題需要解決,而且對于膽管的移植仍然無法完全解決術后狹窄梗阻和Oddi括約肌功能恢復的問題。近年來,由于人類器官短缺,異種移植已經成為當今器官移植學的新領域。為有效解決器官短缺問題,這就有必要探討新的供體材料。豬是目前被認為最有可能進行人類異種器官移植的動物。國內外學者雖已將豬到人異種移植進行了實驗研究和臨床應用,但對異種移植所涉及的豬膽管的力學特性的比較研究國內外報道很少。轉基因動物作為器官移植的供體受到重視,培育表達人類補體調節(jié)蛋白的轉基因豬已告成功,超急性排斥反應已被克服,從而使豬到人異種器官移植極具吸引力和挑戰(zhàn)性。異種移植供源,除了滿足生理功能和克服免疫原性的障礙外,其解剖學和生物力學的匹配性也是移植成功與否的重要因素,這就有必要從生物力學角度探討豬膽總管作為異種移植器官和作為組織工程膽管材料可行性。 第一部分豬膽管作為人膽管移植替代材料的生物力學評價 目的：通過對豬與人膽總管生物力學的比較研究,探討其生物力學特性之間的關系,從生物力學方面評價豬膽總管作為人膽管移植替代材料的可行性。 方法：健康2月齡湖北白豬50頭(雄性30頭,雌性20頭),隨機分為10組。普食飼養(yǎng),分別于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月齡時用氯胺酮肌肉注射(5mg/kg)麻醉宰殺5頭(雄性3頭,雌性2頭),測量膽總管在體長度后取出。人膽總管取自無肝膽疾病、年齡在20-40歲意外死亡的5例成年尸體。每個標本做5μm冰凍橫斷面切片,H-E法染色。用計算機圖像分析儀測量膽總管的壁厚和直徑等幾何形態(tài)學指標。用e-ruler計算機軟件測量膽總管的張開角。用生物力學試驗機對膽總管進行壓力—直徑關系試驗,計算出增量彈性模量(identical incremental elastic modulus, Einc),壓力-應變彈性模量(pressure-strain elastic modulus, Ep),容積彈性模量(volume elastic modulus, Ev)和順應性(compliance, C)等力學特性參數(shù)。免疫組織化學的方法染色,用激光共聚焦顯微鏡檢測膽總管壁膠原纖維、平滑肌和彈性纖維的熒光定量表達,計算顯微結構成份的含量。 結果： 1.豬的體重、肝的重量和體積隨月齡的變化：豬的體重、肝的重量和體積隨著月齡的增加而增大,6-7月齡豬的體重、肝的重量和體積與成人的相近(F=109.15,P=0.08)。 2.豬與人膽總管幾何形態(tài)的比較：人與各月齡組豬膽總管的壁厚(F=6.46,P=0.00)、直徑(F=9.56,P=0.00)和長度(F=13.29,P=0.00)在總體上差異有統(tǒng)計學意義；3-6月齡豬膽總管的壁厚和直徑比成人的小(P0.01),7-10月齡豬膽總管的壁厚和直徑與成人的相近(P0.05)；各月齡組豬膽總管的長度均比成人的短(P0.01)。 3.豬與人膽總管張開角的比較：3-12月齡豬膽總管的張開角隨月齡增加而逐漸增大(P0.05),7月齡時趨于穩(wěn)定。7-12月齡豬膽總管的張開角變化不明顯,且與成人的相近(P0.05)。 4.豬和人膽總管的彈性模量與壓力的關系：豬與人膽總管的Einc、Ep和Ev均隨壓力的上升而增大,當壓力達4kPa時,膽總管的直徑不再變化,彈性模量也隨之不變或變化很小,曲線趨于平緩。 5.人與豬膽總管彈性模量的比較：單因素方差分析顯示,人與各月齡組豬膽總管的Einc(F=502.08,P=0.00)、Ep(F=137.42,P=0.00)和Ev(F=134.59,P=0.00)在總體上差異有統(tǒng)計學意義；3-6月齡及11、12月齡豬的彈性模量比成人的大(P0.01),7-10月齡豬膽總管的彈性模量與成人的相近(P0.05)。 6.各月齡豬膽總管順應性的變化：豬膽總管的順應性先隨月齡增加而增大,10月齡后又減小。豬膽總管順應性隨月齡的變化與彈性模量相反。 7.人與豬膽總管順應性的比較：單因素方差分析顯示,人與各月齡組豬膽總管的順應性在總體上差異有統(tǒng)計學意義(F=62.93,P=0.00)；7-10月齡豬膽總管的順應性與成人的相近(P0.05),而3-6月齡及11、12月齡豬膽總管的順應性明顯小于成人(P0.01)。 8.人與豬膽總管的顯微結構成分的含量：豬與人膽總管組織結構相似。各月齡組豬膽總管的平滑肌(F=89.85,P=0.001)、膠原纖維(F=273.69,P=0.003)和彈性纖維(F=182.60,P=0.006)的含量隨月齡的而變化。其中平滑肌和彈性纖維的含量隨月齡的增加而增多,膠原纖維的含量和膠原纖維/彈性纖維比值(Collagen/Elastin, C/E值)隨月齡的增加而減少。7-10月齡豬膽總管的平滑肌、膠原纖維和彈性纖維的含量與成人的差異不明顯(P0.05)。 結論：豬膽總管的生物力學特性隨年齡的變化而變化。7-10月齡豬膽總管的幾何形態(tài)、張開角、彈性模量、順應性和顯微結構成分等生物力學特性與成人的比較匹配。從豬膽總管的年齡和生物力學特性的相關性提示,7-10月齡豬的膽總管作為人異種移植膽管供源是可能的。 第二部分豬膽管脫細胞支架的制備及組織學和生物力學評價 目的：用不同的脫細胞方法對豬膽總管進行處理,從豬膽總管脫細胞前后的組織學和生物力學特性方面進行評價,探索一種合適的脫細胞方法,為組織工程膽管支架材料的應用提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 1.分組：30段豬膽總管,沿縱軸制作成30mm×12mm的樣本,隨機分為5組(每組6例)：新鮮對照A組及脫細胞B組、脫細胞C組、脫細胞D組和脫細胞E組。 2.脫細胞處理：分別用四種方法脫細胞(B組：0.05%胰蛋白酶+核酸酶,C組：0.1%SDS+核酸酶,D組：1.0%Triton X-100+核酸酶,E組：1.0%Triton X-100+0.1%SDS+核酸酶)。處理過程為37℃恒溫下持續(xù)振蕩24h.PBS液反復漂洗。 3.脫細胞效果觀察：HE染色,光鏡觀察脫細胞基質的組織結構和細胞殘留情況。 4.脫細胞基質的核酸(DNA)含量測定：用紫外分光光度法檢測脫細胞基質的DNA含量,計算脫細胞率 5.生物力學試驗：將標本均沿縱軸裁成20mm×10mm的樣本條,在TestResources生物力學試驗機上進行加載一卸載試驗和極限抗張強度試驗。計算出生物力學材料常數(shù)(α1、β1、α2、β2)、彈性模量、極限抗張強度和斷裂伸長率等指標。 結果： 1.光鏡觀察證實,四種方法脫細胞后,豬膽總管壁的細胞不同程度被去除。脫細胞B組有少量細胞殘留,纖維有損傷；脫細胞C組、D組、E組的細胞均被去除,纖維無明顯損傷。 2.A組的DNA含量為71.24±2.56μg/100mg。B、C、D、E4個脫細胞組的DNA含量與A組的差異有統(tǒng)計學意義(F=15.29,P=0.00),4個組均有明顯的脫細胞效果(P0.01),B組的脫細胞率為77.03%,比C組、D組、E組的脫細胞效果稍差(P0.05),E組的脫細胞率高達99.03%。 3.D、E2個脫細胞組膽總管的生物力學材料常數(shù)(α1、β1、α2、β2)與A組的差異無統(tǒng)計學意義(F=12.21,P=0.06),B組、D組比A組、C組和E組的小(P0.01),D組和E組2個脫細胞組之間差異不明顯(P0.05),E組的更接近A組。 4.D組、E組2個脫細胞組膽總管的彈性模量比A組的稍增大,但差異不明顯(P0.05),B組、C組比A組的小(P0.05),D組和E組2個脫細胞組之間差異不明顯(P0.05)。 5.脫細胞D組、E組的UTS值和SOF值與A組差異不明顯(P0.05)；脫細胞B組、C組的UTS值明顯小于A組(P0.05),SOF值明顯大于A組(P0.05)；脫細胞D組、E組的UTS值和SOF值之間無明顯差異(P0.05)。 結論： 1.0.05%胰蛋白酶+核酸酶組的脫細胞效果欠佳,DNA剩余量較多,膽總管ECM結構完整性受到了破壞,生物力學特性變化表現(xiàn)為材料常數(shù)變小,剛度變小、強度明顯降低和伸展性增加。 2.0.1%SDS+核酸酶組的脫細胞效果雖然好,但生物力學特性發(fā)生了與B組相似的改變。 3.1.0%Triton X-100+核酸酶和1.0%Triton X-100+0.1%SDS+核酸酶2個組的脫細胞效果好,且不會影響豬膽總管的生物力學特性,前者的脫細胞率為95.42%,而后者的脫細胞率高達99.03%,能更好地降低膽總管的免疫原性,是一種比較理想的豬膽總管脫細胞方法。 4.從免疫原性和生物力學角度考慮,1.0%Triton X-100+0.1%SDS+核酸酶的脫細胞方法制成的脫細胞豬膽總管,是構建組織工程膽管的良好支架材料。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.0

【參考文獻】

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本文編號：2558679