【摘要】：血管移植是目前血管病治療的一種普遍手術(shù)方法,由于自體血管移植存在種種缺陷,因此應(yīng)用細(xì)胞或不應(yīng)用細(xì)胞的組織工程血管支架在體外試驗(yàn)中被研制。但是這類方法制作的血管花費(fèi)大量的時(shí)間,并不適用于緊急治療的需要。而目前臨床應(yīng)用的人造血管由于易于急性血栓形成往往限于直徑較大血管,且遠(yuǎn)期研究?jī)?nèi)皮化率較低,小口徑人造血管易于血栓的高形成率目前尚無(wú)法適用臨床治療。具有生物活性的組織工程血管支架(TEVG)如果要用于血管移植對(duì)材料和其攜帶的生物活性物質(zhì)的高組織相容性提出要求。在本研究中我們闡述了應(yīng)用靜電紡絲技術(shù),同時(shí)采用高分子聚合材料PLLA/PCL,一步法制作的具有生物活性、人工合成、可降解、高組織相容性并具有細(xì)胞外基質(zhì)特性的小口徑組織工程血管支架,同時(shí)將這一新型血管支架移植于動(dòng)物體內(nèi),并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究其在原位血管重建的功能,同時(shí)發(fā)現(xiàn)這類新型血管支架在重建過程中具有同時(shí)吸引兩種干細(xì)胞的功能。 第一部分靜電紡絲PLLA/PCL小口徑血管支架的制作和特性研究 目的：應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)選折合適材料制作具有生物力學(xué)特性的組織工程血管支架。 方法：使用高分子可降解材料左旋聚乳酸/聚己酸內(nèi)酯以19%/5%的質(zhì)量比例濃度混合物和單純左旋聚乳酸分別溶解于六氟異丙醇,應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)電紡于直徑為1mm的圓柱形棒狀接收屏,制成組織工程血管支架,在掃描電鏡分析紡絲直徑并測(cè)試其機(jī)械力學(xué)特性。 結(jié)果：1.濃度為19%PLLA/5%PCL溶液靜電紡所得的纖維平均直徑982.3nm符合納米材料的直徑要求。2.靜電紡所得組織工程血管支架平均內(nèi)徑1.000mm±0.013mm,平均外徑1.302mm±0.021mm,平均厚度150.1μm±10.5μm。3.19%PLLA/5%PCL支架平均楊氏模量為5.19±0.7Mpa,19%PLLA和自體血管分別為12.85±0.11Mpa、9.66±0.13Mpa,具有顯著差異P0.05。 結(jié)論：采用靜電紡絲技術(shù)制備的組織工程小口徑血管支架的纖維寬度及空隙達(dá)到納米材料級(jí)別。PLLA/PCL的抗拉性和延展性明顯優(yōu)于單純PLLA和自體血管,是較為理想的生物材料。PLLA/PCL支架的最大受力顯著優(yōu)于單純PLLA材料,但較自體血管小。 第二部分肝素-SDF-1α交聯(lián)的組織工程血管支架的藥物釋放及移植后物理特性研究 目的：應(yīng)用共價(jià)鍵化合特性將肝素交聯(lián)與血管支架上,基于肝素可與SDF-1α靜電電荷作用原理交聯(lián)SDF-1α于血管支架上,并檢測(cè)其穩(wěn)定性。使用采用血管內(nèi)直徑為1mm TEVG,應(yīng)用端端吻合技術(shù)植入SD大鼠的頸總動(dòng)脈內(nèi),研究其血管通常率和生物組織力學(xué)改特性的變。 方法：使用0.01N NaOH處理支架表面以增加羧基密度后應(yīng)用碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺供價(jià)連接與羧基,使用聚乙二醇二胺作為肝素連接分子將肝素交聯(lián)于TEVG,用甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定肝素的釋放。SDF-1α與肝素相互作用后與肝素交聯(lián),通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定測(cè)定SDF-1α的釋放。免疫組化觀察不同濃度的SDF-1α交聯(lián)后的染色強(qiáng)度。應(yīng)用端端吻合技術(shù)吻合TEVG于SD大鼠左頸總動(dòng)脈之上,多普勒超聲驗(yàn)證各時(shí)間點(diǎn)血管通暢程度,各時(shí)間點(diǎn)取出支架后測(cè)試機(jī)械力學(xué)特性。 結(jié)果：通過甲苯胺藍(lán)試劑法測(cè)定,平均每個(gè)PLLA/PCL支架肝素含量濃度為15.31±2.31μg/mm3。通過夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定,以500ng/mlSDF-1α起始交聯(lián)濃度,平均每個(gè)PLLA/PCL支架SDF-1α含量濃度為140.5±4.1nng/mm3。SDF-1α交聯(lián)的起始溶液濃度和支架SDF-1α的結(jié)合濃度呈等比關(guān)系。手術(shù)結(jié)束即刻通暢率為100%,肝素-SDF-1α組在除在第一周通暢率與肝素組接近外(88.9%),其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝素-SDF-1α組的通暢率最高P0.05,肝素組的通暢率也高于空白對(duì)照組P0.05。肝素-SDF-1α組支架在4周后的機(jī)械強(qiáng)度與自體血管較為接近,達(dá)到了組織工程血管支架的力學(xué)要求,各時(shí)間點(diǎn)肝素-SDF-1α生物力學(xué)特性明顯優(yōu)于其他兩組(P0.05)。 結(jié)論：19%PLLA/5%PCL二元共混靜電紡絲,具有良好的肝素交聯(lián)性能。肝素化PLLA/PCL支架可高效結(jié)合SDF-1α,制備有效的具有生物活性TEVG, SDF-1α起始交聯(lián)濃度可定為500ng/m1。肝素-SDF-1α組的TEVG近期及遠(yuǎn)期通暢率均明顯高于肝素組和空白對(duì)照組。肝素-SDF-1α組的TEVG在4周內(nèi)其彈性強(qiáng)度(彈性模量)接近并超過了自體血管的強(qiáng)度,肝素組和空白對(duì)照組在12周后彈性模量也接近了自體血管,19%PLLA/5%PCL的TEVG在植入體內(nèi)后其生物力學(xué)特性可接近自然血管。 第三部分血管支架內(nèi)表面內(nèi)皮化功能的研究 目的：通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究生物活性組織工程血管支架內(nèi)皮化效率和機(jī)制。 方法：1.體外試驗(yàn)：體外培養(yǎng)牛內(nèi)皮細(xì)胞,M199培養(yǎng)液中加入不同濃度的SDF-la溶液,研究不同濃度SDF-1α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。2.取出不同時(shí)間點(diǎn)的TEVG,應(yīng)用免疫組化方法分析TEVG內(nèi)表面的內(nèi)皮化率和內(nèi)皮化機(jī)制。 結(jié)果：對(duì)照組、肝素組15μg/ml、SDF-1α組濃度分別為20ng/ml、50ng/ml、150ng/ml時(shí),ECs細(xì)胞遷移數(shù)分別為3.5±0.58個(gè),7.9±1.09個(gè),18.3±1.73個(gè),24.7±2.05個(gè),31.1±2.46個(gè),具有顯著差異P0.05。1周的SDF-1α組TEVG內(nèi)表面吸引更多的細(xì)胞(1570±413mm2,n=3),具有顯著差異性P0.05,且可以觀察到大量CD34+/CD133+/CD31-的EPCs聚集于內(nèi)表面。4周的SDF-1α組內(nèi)皮化率高于其他兩組,CD34/CD133表達(dá)下調(diào),內(nèi)皮細(xì)胞成熟。 結(jié)論：1.體外試驗(yàn)SDF-1α可有效吸引內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,證明SDF-1α可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。2.肝素-SDF-1α交聯(lián)組的組織工程血管(TEVG)可有效的全程吸引內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs),在4周內(nèi)即有效全程內(nèi)皮化。 第四部分血管支架外表面的研究 目的：通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究生物活性組織工程血管支架對(duì)平滑肌祖細(xì)胞的吸引能力和平滑肌細(xì)胞分化成熟的能力研究。 方法：1.體外試驗(yàn)：手術(shù)取出各組種植3天TEVG體外細(xì)胞培養(yǎng)并鑒定細(xì)胞,并用Real-time PCR的檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)平滑肌細(xì)胞特異標(biāo)記物α-SMA、CNN1對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：免疫熒光法檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組外周組織的α-SMA、 MHC、CNN1、Sox10、Sox17表達(dá),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率,Verhoeff s彈力蛋白染色檢測(cè)第4周時(shí)TEVG外周組織彈力蛋白和膠原蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.體外試驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)除肝素-SDF-1α組外,肝素組和對(duì)照并無(wú)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)。1周細(xì)胞僅表達(dá)α-SMA,而CNN1和MHC均為陰性表達(dá),4周細(xì)胞表達(dá)α-SMA同時(shí)CNN1和MHC表達(dá)大幅增高,Real-time PCR的結(jié)果顯示隨著時(shí)間推移細(xì)胞的α-SMA和CNN1的mRNA的表達(dá)逐漸增加,統(tǒng)計(jì)分析具有顯著差異P0.01。2.體外試驗(yàn)：1周TEVG外層組織SDF-1α組α-SMA的陽(yáng)性細(xì)胞率為87.2±5.1%(n=3),明顯高于肝素組64.2±4.2%(n=3)和對(duì)照組46.2±3.7%(n=3),統(tǒng)計(jì)有顯著差異P0.05,4周時(shí)肝素-SDF-1α組CNNl和MHC的陽(yáng)性細(xì)胞率為89.7±4.9%(n=5)高于肝素組72.3±3.4%(n=4)和對(duì)照組31.2±2.7%(n=3),統(tǒng)計(jì)有顯著差異P0.05。4周外層組織雙染COL1/MHC,分析兩種蛋白表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)肝素-SDF-1α組的COL1密度明顯高于對(duì)照組和肝素組,Verhoeff's彈力蛋白染色表面肝素-SDF-1α組彈性蛋白和膠原明顯高于其他組。 結(jié)論：1.通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一種Sox10+/Sox17+/CD34-的具有平滑肌祖細(xì)胞特性的干細(xì)胞。2.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)肝素-SDF-1α交聯(lián)的TEVG具有強(qiáng)大的平滑肌祖細(xì)胞吸引功能,并刺激平滑肌祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞方向分化、增殖,表達(dá)相關(guān)蛋白產(chǎn)物。
【圖文】：
Microfiber圖1-1 肝素_SDF-la交聯(lián)示意圖1. 2 材料和方法1.2.1實(shí)驗(yàn)材料左旋聚乳酸(Poly — L_lactic acid, PLLA),分子量 67400，由 Sigraa-Aldrich公司提供。聚己酸內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL),分子量 2000，由 Polysciences公司提供。六氟異丙醇（1，1, 1，3, 3，3-Hexafluoro-2-propanol , HFIP),由 Aladdin公司提供。聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)，由 Sigraa-Aldrich 公司提供。碳化二亞胺(EDC)
1.2. 3.2 靜電紡絲裝置、原理及方發(fā)靜電紡絲裝置如圖1一2所示，利用高壓直流電源提供高壓電源，正極輸出的電極連接于注射器針頭。圓柱形棒狀接收屏（直徑為1.0mm，長(zhǎng)8cm) —端與陰極相連，，圓柱形棒狀接收屏與針頭距離為9cra,另一端與有旋轉(zhuǎn)和平行動(dòng)程的動(dòng)力裝置導(dǎo)管成型機(jī)相連。導(dǎo)管成型機(jī)旋轉(zhuǎn)最大速度為1000r/min[28]�！窼oiulion、"eservcir Nozzle .— Fiber jeti ?、 / ^ 嚴(yán) Static DCvcltage Translation圖1 — 2靜電紡絲裝置示意圖(1)如圖1-2連接注入19%PLLA/5%PCL及19%PLLA混合溶液的于3ml注射器微量泵固定，設(shè)置速度Iml/hr，注射量為0.15ml，圓柱形棒狀接收屏(直徑為1.0mm，長(zhǎng)Son)兩端與動(dòng)力裝置導(dǎo)管成型機(jī)相連接
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R318.08;R654
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2537715
