【摘要】：研究背景:關(guān)節(jié)骨軟骨組織是人體關(guān)節(jié)重要的負(fù)重組織,關(guān)節(jié)疾病及創(chuàng)傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)骨軟骨損傷十分常見,是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙甚至肢體殘疾的主要疾病,給病人及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。Curl等回顧性分析了31516例行膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的患者,63%的患者發(fā)現(xiàn)有軟骨損傷。由于透明軟骨組織無血液供應(yīng),缺乏祖細(xì)胞聚集途徑,一旦損傷,難以自身修復(fù)�，F(xiàn)有的臨床治療策略包括:保守治療、關(guān)節(jié)腔清理術(shù)、微骨折術(shù)、軟骨細(xì)胞移植、自體或異體骨軟骨移植及人工關(guān)節(jié)置換等技術(shù),但以上治療策略均存在有明顯的缺陷,長期治療效果難以令人滿意。目前常用的治療策略以微骨折術(shù)為代表,它通過破壞鈣化軟骨層結(jié)構(gòu),使得軟骨缺損由血凝塊所填充,而該血凝塊中富含骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入骨軟骨缺損區(qū)增殖并分化為纖維軟骨細(xì)胞,刺激骨軟骨缺損區(qū)域纖維軟骨修復(fù)。以達(dá)到緩解癥狀,填充缺損,延緩OA的發(fā)生等作用,但其遠(yuǎn)期療效欠佳。而骨軟骨移植及軟骨細(xì)胞移植由于組織、細(xì)胞來源有限,且會(huì)造成供區(qū)損傷,制約了其應(yīng)用。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)創(chuàng)傷較大,適用于嚴(yán)重的關(guān)節(jié)骨軟骨損傷或終末期關(guān)節(jié)疾病軟骨大量破壞的情況下,術(shù)后并發(fā)癥及假體長期生存率仍有待提高。組織工程骨軟骨技術(shù)是以再生醫(yī)學(xué)方式治療關(guān)節(jié)骨軟骨損傷最為理想的新方法。但現(xiàn)階段工程化的骨軟骨組織與宿主組織整合較差、存在纖維軟骨樣退變、力學(xué)性能較低下,難以確保其治療關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的長期有效性。我們認(rèn)為導(dǎo)致以上現(xiàn)象的主要原因是現(xiàn)階段構(gòu)建的工程化骨軟骨組織在結(jié)構(gòu)和功能上都存在有明顯的缺陷,特別是缺少透明軟骨層與軟骨下骨層之間的界層連接結(jié)構(gòu),即:鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)。鈣化軟骨層是介于透明軟骨層與軟骨下骨層之間的界層連接結(jié)構(gòu),通過上方的波浪形潮線結(jié)構(gòu)及下方的不規(guī)則粘合線結(jié)構(gòu)與透明軟骨層及軟骨下骨層緊密鉚合[1]。鈣化軟骨層由大量的有機(jī)膠原纖維及無機(jī)礦物質(zhì)組成,其結(jié)構(gòu)致密,平均厚度為104.16±20.87μm,在物質(zhì)通透及力學(xué)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要功能。研究發(fā)現(xiàn)鈣化軟骨層具有隔離帶的作用,其隔離帶作用具有阻止成骨性和成軟骨性細(xì)胞相互遷移,使其于特定區(qū)域增殖并定向分化,為成骨和成軟骨提供獨(dú)立的生長微環(huán)境。在骨關(guān)節(jié)炎病理發(fā)病過程的早期可觀察到鈣化軟骨層發(fā)生穿孔,并伴有血管、神經(jīng)的長入及通透性的改變,同時(shí)潮線發(fā)生復(fù)制及漂移等現(xiàn)象。因此在骨軟骨組織工程研究中,構(gòu)建出含致密鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架可能具有重要意義。因此,在對鈣化軟骨層的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上,我們提出了一體化構(gòu)建包括透明軟骨層、鈣化軟骨層及軟骨下骨層的三層仿生骨軟骨支架的新理念。利用脫細(xì)胞骨支架復(fù)合Ⅱ型膠原蛋白水凝膠,采用凍干交聯(lián)的方法制備含天然鈣化層結(jié)構(gòu)的仿生型骨軟骨支架。一體化構(gòu)建就是在支架制備的過程中使軟骨支架與骨支架直接結(jié)合成整體。同時(shí),為了給軟骨層及軟骨下骨層提供獨(dú)立的培養(yǎng)微環(huán)境,我們在構(gòu)建的含天然鈣化層結(jié)構(gòu)的仿生型骨軟骨支架的基礎(chǔ)上,以聚乳酸(Polylactic acid,PLA)為原材料,運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(Computer aided design,CAD)技術(shù)及三維打印快速成型技術(shù)(3DP)構(gòu)建了雙室培養(yǎng)系統(tǒng)。為驗(yàn)證該雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的可行性,并進(jìn)一步證明鈣化軟骨層的隔離帶作用。我們以人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞,接種于含天然鈣化層結(jié)構(gòu)的仿生型骨軟骨支架上,并通過雙室培養(yǎng)系統(tǒng)為軟骨層及軟骨下骨層提供成軟骨及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。通過細(xì)胞示蹤技術(shù)、組織切片技術(shù)、PCR技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段檢測種子細(xì)胞在支架內(nèi)的粘附、增殖、分化及遷移等生物學(xué)行為。最后,我們選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行骨軟骨缺損造模,使用經(jīng)雙室培養(yǎng)后的含種子細(xì)胞的骨軟骨支架植入該骨軟骨缺損,觀察該仿生型骨軟骨支架在修復(fù)骨軟骨缺損中的作用,并與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架的修復(fù)效果相對比。第一部分含天然鈣化軟骨層仿生組織工程骨軟骨支架的制備及檢測本部分研究中,我們鉆取正常豬膝關(guān)節(jié)股骨髁負(fù)重面骨軟骨柱,削去骨柱透明軟骨部分。切下的透明軟骨用于Ⅱ型膠原蛋白提取,而含鈣化軟骨層的軟骨下骨柱行脫細(xì)胞處理。然后將提取的Ⅱ型膠原蛋白水凝膠接種于鈣化層之上,經(jīng)過凍干及交聯(lián)等步驟,獲得含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架,并對支架相關(guān)特性進(jìn)行檢測。一、實(shí)驗(yàn)方法1.含天然鈣化軟骨層骨柱的制備及檢測(1)鉆取直徑為12 mm的含有天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)的骨柱,削去透明軟骨層;(2)Triton X-100脫去骨柱中的細(xì)胞;(3)HE染色及DAPI染色觀察骨柱中細(xì)胞是否洗脫干凈。2.Ⅱ型膠原蛋白水凝膠的制備(1)獲取透明軟骨粉;(2)胃蛋白酶消化,鹽析及透析。3.骨軟骨支架的制備及檢測(1)三維打印構(gòu)建骨軟骨支架制備模具;(2)通過模具在脫細(xì)胞骨支架上灌注Ⅱ型膠原蛋白水凝膠,再通過凍干、交聯(lián)等步驟制備骨軟骨支架;(3)檢測支架孔隙率、孔徑、細(xì)胞毒性及結(jié)構(gòu)特征。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建的骨軟骨支架呈深藍(lán)色,細(xì)胞洗脫徹底,Ⅱ型膠原蛋白海綿支架平均孔隙率為(96.1±3.8)%,掃描電鏡下測其孔徑平均大小為(102.3±35.3)μm,脫細(xì)胞軟骨下骨支架的平均孔隙率為(73.5±2.6)%,其平均孔徑大小為(470.2±158.8)μm,呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔隙結(jié)構(gòu)良好,孔孔相通。支架浸提液對細(xì)胞生長無明顯影響。第二部分含天然鈣化軟骨層仿生支架雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建本部分研究中,為了給軟骨層及軟骨下骨層提供獨(dú)立的培養(yǎng)微環(huán)境,我們設(shè)計(jì)了基于鈣化軟骨層的雙室培養(yǎng)系統(tǒng),利用鈣化軟骨層的隔離帶作用,為軟骨腔及軟骨下骨腔分別提供成軟骨及成骨培養(yǎng)基。在成軟骨及成骨的環(huán)境中,誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分別向軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的方向分化。這種雙室培養(yǎng)系統(tǒng)更加符合骨軟骨組織的生理特征,因此可能構(gòu)建出更加仿生的骨軟骨缺損修復(fù)材料。一、實(shí)驗(yàn)方法1.雙室培養(yǎng)裝置的構(gòu)建(1)運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)設(shè)計(jì)雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)三維模型;(2)運(yùn)用三維打印技術(shù)制備雙室培養(yǎng)系統(tǒng)各部件;(3)組裝雙室培養(yǎng)系統(tǒng),并進(jìn)行密閉性測試,Co60輻照滅菌。2.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)I型膠原酶消化法獲取人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,差速消化法進(jìn)行純化。3.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架共培養(yǎng)(1)CFDA SE及Di I標(biāo)記人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞;(2)細(xì)胞懸液接種法及凝膠接種法接種CFDA SE標(biāo)記的細(xì)胞于膠原層,Di I標(biāo)記的細(xì)胞于軟骨下骨層,并進(jìn)行雙室培養(yǎng);(3)通過病理切片、熒光定量PCR、支架總DNA含量檢測等手段,檢測支架中細(xì)胞粘附、生長、增殖、分布及分化情況。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙室培養(yǎng)7天后,熒光顯微鏡下可觀察到膠原層CFDA SE標(biāo)記的綠色熒光細(xì)胞,軟骨下骨層Di I標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞,綠色熒光細(xì)胞與紅色熒光細(xì)胞分別位于鈣化軟骨層兩邊,無跨鈣化層細(xì)胞遷移現(xiàn)象。熒光定量PCR檢測膠原層內(nèi)種子細(xì)胞的成軟骨標(biāo)志物隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增加,軟骨下骨層內(nèi)種子細(xì)胞的成骨標(biāo)志物隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增加。支架中種子細(xì)胞總DNA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加,因此表明隨著雙室培養(yǎng)時(shí)間的延長,支架內(nèi)種子細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加。第三部分骨軟骨支架動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在前面的研究基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步驗(yàn)證該含天然鈣化層仿生骨軟骨支架對關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的修復(fù)效果。在本部分研究中我們選擇貴州小香豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過手術(shù)方法行膝關(guān)節(jié)股骨髁負(fù)重面骨軟骨缺損造模。植入經(jīng)雙室培養(yǎng)的含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架,觀察其修復(fù)效果,并與空白對照及無天然鈣化層仿生骨軟骨支架的修復(fù)效果進(jìn)行對比。一、實(shí)驗(yàn)方法1.含天然鈣化層仿生骨軟骨支架雙室培養(yǎng)(1)Percoll密度梯度離心法獲取豬BMSCs;(2)復(fù)合支架進(jìn)行雙室培養(yǎng)。2.骨軟骨缺損造模及修復(fù)(1)30頭貴州小香豬隨機(jī)分為3組,每組20膝,共60膝;(2)造模,A組為空白對照組(單純骨軟骨缺損);B組為不含鈣化層骨軟骨支架修復(fù)組;C組為含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復(fù)組;3.修復(fù)效果評估體視顯微鏡觀察,核磁共振檢查,HE染色,固綠—番紅O染色,天狼星紅染色及O’Driscoll組織學(xué)評分評估骨軟骨缺損修復(fù)效果。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架相比,含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架在修復(fù)骨軟骨缺損中具有良好的修復(fù)效果。含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復(fù)組中軟骨下骨層修復(fù)組織與宿主組織無明顯差異,可見完整的鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)。但軟骨缺損部位仍有部分凹陷,修復(fù)組織表面并未與關(guān)節(jié)表面平齊。結(jié)論:通過低溫凍干及京尼平交聯(lián)技術(shù),利用含天然鈣化軟骨層脫細(xì)胞骨基質(zhì)及II型膠原蛋白水凝膠可構(gòu)建出含完整鈣化層結(jié)構(gòu)的三層仿生骨軟骨支架,該支架結(jié)構(gòu)良好,無明顯細(xì)胞毒性。其鈣化軟骨層具有生理性隔離帶作用,利用其生理性隔離帶作用,我們構(gòu)建的雙室培養(yǎng)系統(tǒng)能為軟骨層及軟骨下骨層提供獨(dú)立的生長微環(huán)境。種子細(xì)胞在含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架中生長良好,在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下,軟骨層及軟骨下骨層中的間充質(zhì)干細(xì)胞可分別向成軟骨及成骨方向分化,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,支架內(nèi)種子細(xì)胞含量逐漸增加。在骨軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架相比,含天然鈣化軟骨層的骨軟骨支架在修復(fù)骨軟骨缺損中具有良好的修復(fù)效果,其修復(fù)組織結(jié)構(gòu)及成分與正常骨軟骨組織類似。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文泡于含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 液中待用。2.1.2.2 含鈣化軟骨層骨柱的脫細(xì)胞處理① 將清洗后的含天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)的骨柱置于 10 倍以上體積的含蛋白酶抑制劑的 1% Triton X-100 溶液中，放于恒溫?fù)u床上震蕩洗脫 24 h，，溫度設(shè)定為 30℃，搖床速度設(shè)定為 200 轉(zhuǎn)/min；② 24 h 后用含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 溶液高速離心清洗 3 次③ 重新加入新的10倍以上體積含蛋白酶抑制劑的1% Triton X-100液繼續(xù)行細(xì)胞洗脫處理，如此反復(fù) 3 次，共洗脫 72 h。再用 PBS 溶液高速離心清洗 3 次，可見骨柱由紅色逐漸洗脫變白。4℃冰箱保存待用。

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文泡于含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 液中待用。2.1.2.2 含鈣化軟骨層骨柱的脫細(xì)胞處理① 將清洗后的含天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)的骨柱置于 10 倍以上體積的含蛋白酶抑制劑的 1% Triton X-100 溶液中，放于恒溫?fù)u床上震蕩洗脫 24 h，溫度設(shè)定為 30℃，搖床速度設(shè)定為 200 轉(zhuǎn)/min；② 24 h 后用含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 溶液高速離心清洗 3 次③ 重新加入新的10倍以上體積含蛋白酶抑制劑的1% Triton X-100液繼續(xù)行細(xì)胞洗脫處理，如此反復(fù) 3 次，共洗脫 72 h。再用 PBS 溶液高速離心清洗 3 次，可見骨柱由紅色逐漸洗脫變白。4℃冰箱保存待用。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R687

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1 李s

本文編號(hào)：2522835