【摘要】：干細(xì)胞(stem cells)維持著生命體組織器官的發(fā)生發(fā)展以及損傷的修復(fù)與再生,隨著近年來再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展,干細(xì)胞治療在臨床中的應(yīng)用日益廣泛,療效顯著,已成為很多難治性疾病的終極治療手段,干細(xì)胞的研究已經(jīng)成為全國乃至全世界的研究熱點(diǎn)。在下文中我們將以毛囊干細(xì)胞這一成體干細(xì)胞為研究主體,對(duì)其生物學(xué)特性及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn),以期證明毛囊干細(xì)胞為再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞治療的理想干細(xì)胞源。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.體外分離培養(yǎng)并擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells,HFSCs),建立一種快速高效的細(xì)胞培養(yǎng)體系,為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)； 2.通過體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),將HFSCs定向誘導(dǎo)為皮脂腺細(xì)胞及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞,驗(yàn)證HFSCs的多分化潛能； 3.證實(shí)HFSCs經(jīng)過特殊共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后,可以分化為汗腺樣細(xì)胞(sweat gland cells,SGCs),并可參與汗腺(sweat gland,SG)的修復(fù)與再生； 4.以HFSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建結(jié)構(gòu)和功能更趨于完整的組織工程全層皮膚。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.分別用“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-毛囊剝離-酶消化”兩種方法體外分離HFSCs,并將毛囊組織或細(xì)胞植入鋪有IV型膠原,以絲裂霉素C處理過的成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板中,觀察對(duì)比兩組中細(xì)胞的形態(tài)、生長特性、及體外擴(kuò)增能力的異同,并通過CD200、CD29、CK15等HFSCs特異性標(biāo)記物的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫細(xì)胞熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù),分析、鑒定分離培養(yǎng)的HFSCs; 2.分別建立兩種不同的體外細(xì)胞誘導(dǎo)體系,將HFSCs分別誘導(dǎo)分化為皮脂腺細(xì)胞、表皮細(xì)胞,并通過皮脂腺細(xì)胞及表皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物的免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞熒光染色及脂質(zhì)的油紅O染色,對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行表型分析與鑒定； 3.體外分離培養(yǎng)人手掌或腳掌來源的SGCs及真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(dermal mesenchymal stem cells,d-MSCs),利用transwell細(xì)胞培養(yǎng)板建立了一種特殊的HFSCs共培養(yǎng)體系,主要由熱休克的SGCs及一種仿真皮結(jié)構(gòu)的間質(zhì)組織構(gòu)成,我們又稱之為間質(zhì)飼養(yǎng)層(mesenchymal feeder layer, M-FL)主要包括d-MSCs、 Matrigel基質(zhì)膠以及一定比例的優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS),同時(shí)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組,對(duì)照組1中不包含熱休克SGCs,對(duì)照組2中不包含M-FL；細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué),免疫細(xì)胞熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行SGCs表型鑒定,對(duì)比實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2中細(xì)胞的表型變化情況,同時(shí),通過臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的生長活性,Edu(5'-ethynyl-2'-deoxyuridine)標(biāo)記技術(shù)對(duì)比分析各組中細(xì)胞的增殖能力； 4.體外建立裸鼠腳掌燙傷模型,將HFSCs誘導(dǎo)來源的汗腺樣細(xì)胞(induced-sweat gland cells, i-SGCs)移植到裸鼠腳掌的燙傷部觀察,并以等量Nacl注射作為對(duì)照組,4周后,愈合創(chuàng)面全層皮膚取材,汗腺特異性標(biāo)記物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、細(xì)胞角蛋白14(cytokeratin14, CK14)的免疫組化及免疫熒光染色分析判斷,觀察接受細(xì)胞移植的創(chuàng)面皮膚中是否有新生的汗腺結(jié)構(gòu)存在； 5.蛋白印跡法(western bolt)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR)檢測分析HFSCs誘導(dǎo)前、后的外胚層發(fā)育不良(ectodermal dysplasia,EDA)基因及其受體(ectodermal dysplasia receptor,EDAR)的基因及蛋白表達(dá)的變化,以進(jìn)一步探索HFSCs分化為SGCs的分子機(jī)制； 6.分別以HFSCs (A組),表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells,ESCs)(B組)為種子細(xì)胞體外建立組織工程學(xué)全層皮膚,通過伊紅-蘇木素(hematoxylin-eosin staining, HE)染色分析兩組標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)的異同,觀察A組標(biāo)本中是否有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成；兩組標(biāo)本分別進(jìn)行integrin β1(CD29)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19, CK19)免疫組織化學(xué)染色,觀察陽性細(xì)胞分布多少及分布區(qū)域。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-毛囊剝離-酶消化”兩種細(xì)胞分離方法對(duì)比結(jié)果顯示：應(yīng)用前一種方法培養(yǎng)的第一代細(xì)胞生長至80-90%融合的時(shí)間為13～14天,而后一種方法為8～9天,但是傳代后,從第二代細(xì)胞開始,兩組細(xì)胞的生長速度及增殖能力無明顯差異,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05) 2.經(jīng)過特異性微環(huán)境的誘導(dǎo),HFSCs分別被誘導(dǎo)分化為上皮膜抗原(EMA)及油紅染色陽性的皮脂腺細(xì)胞,以及細(xì)胞角蛋白10(cytokeratin10, CK10)陽性的角質(zhì)形成細(xì)胞； 3.在HFSCs汗腺化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組中,有一部分HFSCs最終被定向誘導(dǎo)分化成為具有汗腺表型的細(xì)胞,對(duì)比之下,對(duì)照組1中沒有細(xì)胞分化為SGCs.對(duì)照組2中只有極少部分細(xì)胞發(fā)生了向SGCs的轉(zhuǎn)化；我們利用細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,通過免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞中HFSCs特異性標(biāo)記物CD200、CD29及CK15的表達(dá)變?nèi)趿?而汗腺細(xì)胞特異性標(biāo)記物CEA和CK14的表達(dá)卻增強(qiáng)了,這說明HFSCs在設(shè)計(jì)的共培養(yǎng)微環(huán)境中可以實(shí)現(xiàn)向SGCs的分化； 4. western blot結(jié)果顯示分化而來的SGCs高表達(dá)EDA和EDAR,RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示EDA基因及EDAR基因在誘導(dǎo)后SGCs中呈高表達(dá)狀態(tài)；而CD29、CD200等HFSCs特異性抗原基因在汗腺化誘導(dǎo)后表達(dá)降低； 5.在隨后的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)中,接受了細(xì)胞注射的裸鼠燙傷腳掌的愈合創(chuàng)面,我們發(fā)現(xiàn)了類似SG的新生結(jié)構(gòu),進(jìn)而行SGCs特異性標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色,結(jié)果顯示這些類似汗腺的結(jié)構(gòu)對(duì)CEA、CK14呈陽性表達(dá),而在Nacl注射組的創(chuàng)面標(biāo)本中,沒有發(fā)現(xiàn)這種類汗腺結(jié)構(gòu)的存在。 6.在以HFSCs為種子細(xì)胞的A組及以ESCs為種子細(xì)胞的B組標(biāo)本中,HE染色結(jié)果顯示,兩組標(biāo)本均由表皮和真皮組成,二者之間以基底層相連接,基底層細(xì)胞排列較為整齊,細(xì)胞偏大,有CK19+和CD29+細(xì)胞散在分布；兩組間標(biāo)本對(duì)比顯示：A組標(biāo)本中,表皮層相對(duì)于B組較厚,分層較多,而且部分標(biāo)本在基底層下方有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成,表皮與真皮結(jié)合較緊密；B組標(biāo)本對(duì)比A組來說,表皮層較薄,分層較少,表皮真皮易分離,基底層附近CK19+和CD29+陽性細(xì)胞較A組標(biāo)本少,基底層下淺真皮層中無毛囊樣結(jié)構(gòu)形成 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1. HFSCs可以在體外適宜的微環(huán)境中被分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增；其中“酶消 化-毛囊剝離-酶消化”法較“酶消化-毛囊剝離-直接種植”法縮短了原代細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間,在實(shí)驗(yàn)中更具優(yōu)勢； 2. HFSCs具有多分化潛能,可以在體外被誘導(dǎo)分化為皮脂腺細(xì)胞及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞； 3. HFSCs可以在適宜的微環(huán)境中,被誘導(dǎo)分化為SGCs; HFSCs作為一種成體干細(xì)胞,有用于治療汗腺缺失的潛能；我們建立的共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系可以有效的將HFSCs定向誘導(dǎo)分化為SGCs,其分子機(jī)制與EDA/EDAR基因的激活有關(guān)；誘導(dǎo)分化而來的汗腺細(xì)胞是有功能的,可以參與皮膚創(chuàng)面中汗腺的再生； 4.以HFSCs為種子細(xì)胞有望構(gòu)建出富含皮膚附屬器的,形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能更趨于完善的組織工程全層皮膚。
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2518279