【摘要】：研究背景及目的 由外傷、炎癥、腫瘤侵蝕粘連、手術(shù)切除或先天畸形等情況引起硬腦（脊）膜缺損在臨床上很常見，這種缺損或愈合不良可以引起很多并發(fā)癥，如腦脊液滲漏、顱內(nèi)感染、腦膜炎和癲癇等，是神經(jīng)外科手術(shù)中經(jīng)常需要解決的一個問題。 傳統(tǒng)的硬腦膜替代材料中，自體組織、同種異體組織、異種組織存在取材不便或潛在病毒感染風(fēng)險等缺點，近年來已較少應(yīng)用，曾經(jīng)使用的人工惰性材料不能體內(nèi)降解，長期存留易產(chǎn)生慢性炎癥和排異反應(yīng)。目前臨床廣泛應(yīng)用的硬腦膜替代材料是異體異種組織中單獨提取的活性膠原蛋白，經(jīng)重組和無害化處理制成薄膜材料稱為膠原基質(zhì)，它不會造成炎癥反應(yīng)或異物反應(yīng)，可以促進(jìn)創(chuàng)面組織修復(fù)和硬腦膜新生并可以自然降解，在臨床應(yīng)用中總體的效果比較滿意。但是膠原基質(zhì)自身力學(xué)強(qiáng)度差，為腦組織提供的保護(hù)有限，硬腦膜下腔封閉不佳等缺點使術(shù)后增加了腦脊液漏的風(fēng)險，限制了其廣泛的應(yīng)用。近年來人工合成可降解聚合物具備了優(yōu)良的力學(xué)性能和體內(nèi)可降解特性，成為組織工程材料研究的熱門，但其不足是自身缺乏生物活性對創(chuàng)面愈合及自身硬腦膜的新生沒有明顯的促進(jìn)作用。 靜電紡絲能夠簡單快速的生成納米纖維，已成為有效制備納米纖維材料的主要途徑之一。電紡材料具有良好的超微構(gòu)造，能構(gòu)建類細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)構(gòu)，其相互連通的孔隙有利于細(xì)胞長入，有高度的表面體積比，擴(kuò)大了與細(xì)胞的接觸面積，因此靜電紡絲技術(shù)廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。 本研究的目的是模仿天然硬腦膜的構(gòu)造，使用靜電紡絲技術(shù)制作復(fù)層結(jié)構(gòu)硬腦膜替代材料，結(jié)合活性膠原與人工合成可降解材料各自的優(yōu)點，在整體保留良好力學(xué)性能同時，通過分層結(jié)構(gòu)讓材料的內(nèi)表面減少與腦組織的粘連，中間層起到加固和防水作用，外層含有膠原成分發(fā)揮生物活性并促進(jìn)組織再生。提出復(fù)層電紡膜作為硬腦膜替代材料的研究意義和應(yīng)用前景。 研究方法 1.電紡膜的制備：靜電紡絲制作不同配比的膠原、PCL和PLA電紡膜材料，根據(jù)力學(xué)性能，柔軟度和電紡穩(wěn)定性確定各層電紡膜成分構(gòu)成，優(yōu)化電紡參數(shù)并制作完整的復(fù)層電紡膜修補(bǔ)材料。 2.電紡膜的表征及特性：掃描電子顯微鏡下觀察電紡膜的微觀形態(tài)，測量纖維直徑及孔徑。測量力學(xué)性能、吸水率、孔隙率、防水性、體外降解率等，并與膠原基質(zhì)進(jìn)行對比測試。 3.電紡膜的細(xì)胞相容性及內(nèi)外層結(jié)構(gòu)對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞功能的影響：分別在內(nèi)外層材料上培養(yǎng)HSF細(xì)胞，，觀察電紡膜表面的細(xì)胞生長情況，吖啶橙染色MTT檢測材料的細(xì)胞相容性；粘附實驗、定量PCR和Western blot等方法，對比內(nèi)外層上生長的成纖維細(xì)胞粘附性和分泌細(xì)胞外基質(zhì)等主要功能，了解內(nèi)外層材料對細(xì)胞活性的影響。 4.電紡膜動物體內(nèi)植入實驗：SD大鼠皮下植入電紡膜以驗證生物相容性，HE染色，掃描電鏡觀察電紡膜表面和內(nèi)部的細(xì)胞生長情況。構(gòu)建新西蘭兔硬腦膜缺損動物模型，電紡膜作為硬腦膜替代材料植入實驗，驗證材料的動物體內(nèi)植入效果，HE染色觀察電紡膜內(nèi)部細(xì)胞生長情況，植入部位腦組織HE染色觀察材料植入的實際效果和影響。 實驗結(jié)果 1.通過電紡參數(shù)優(yōu)化和電紡膜力學(xué)性能測試確定了復(fù)層電紡膜的構(gòu)成。PLA為內(nèi)層材料；PLA/PCL(1/1)電紡膜在實驗分組中擁有最大的抗拉強(qiáng)度，并且斷裂伸長與柔軟度較好，用于中層材料制作；6%wt膠原/PLA(4/1)電紡溶液組在保證膠原含量最大化的前提下能夠得到穩(wěn)定良好的電紡纖維，用于外層材料的制作。通過連續(xù)的分層電紡技術(shù)制作復(fù)層電紡膜，通過電紡時間控制材料的厚度，內(nèi)層電紡時間2h、中層4h、外層6h，靜電紡絲完成后整個電紡膜厚度約為150~300μm。 2.電紡膜與膠原基質(zhì)在力學(xué)性能、孔隙率、吸水率、防水性上進(jìn)行對比測試，電紡膜各項性能有顯著提高。 3. HSF細(xì)胞能夠在電紡膜內(nèi)外層材料上生長并正常增值，吖啶橙染色與MTT檢測顯示在材料外層上生長的細(xì)胞增值性優(yōu)于內(nèi)層和培養(yǎng)板對照；粘附實驗顯示外層材料有利于HSF細(xì)胞粘附；定量PCR和Western blot的結(jié)果顯示在外層材料上生長的HSF細(xì)胞在分泌細(xì)胞外基質(zhì)功能上優(yōu)于內(nèi)層和培養(yǎng)板對照。 4.大鼠皮下植入電紡膜后組織細(xì)胞能夠在材料內(nèi)外層上貼附并生長，HE染色顯示外層材料較內(nèi)層材料中有更多成纖維細(xì)胞和表皮樣細(xì)胞遷移生長入內(nèi)部。構(gòu)建新西蘭兔硬腦膜缺損動物模型，植入復(fù)層電紡膜替代材料術(shù)后動物恢復(fù)良好，未出現(xiàn)切口感染和顱內(nèi)感染征象。電紡膜材料取出時內(nèi)表面與腦組織無明顯粘連，材料外層則與周圍組織緊密貼合，剝離時有一定阻力；移植部位及周邊的腦組織表面顏色正常、無明顯損傷、水腫、炎性反應(yīng)。電紡膜HE染色可見材料外層較內(nèi)層有更多成纖維和表皮樣細(xì)胞長入其中；植入部位腦組織HE染色顯示電紡膜與自身筋膜對照組沒有明顯差異，均未出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)及肉芽組織增生的痕跡。 結(jié)論 本課題運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)制作了具有良好超微結(jié)構(gòu)的復(fù)層硬腦膜替代材料，其結(jié)構(gòu)模仿了天然硬腦膜，成分為內(nèi)層PLA、中層50%PLA50%PCL、外層80%膠原20%PLA，三層的厚度比例約為1:2:3，總體厚度約為150~300μm。電紡膜與臨床常用的膠原基質(zhì)材料對比在力學(xué)性能、吸水率、孔隙率、防水性上有明顯提高。通過在電紡膜上培養(yǎng)HSF細(xì)胞驗證了電紡膜有良好的細(xì)胞相容性，證實了材料外層含有的活性膠原成分有利于增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的粘附及分泌等功能，通過大鼠皮下植入和新西蘭兔硬腦膜缺損植入實驗驗證了電紡膜的組織相容性，證實了材料內(nèi)層與周圍組織沒有產(chǎn)生明顯粘連，膠原外層有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用。這種新型復(fù)層電紡膜作為硬腦膜替代材料具有科學(xué)研究的意義和應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

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本文編號：2464837