發(fā)布時(shí)間：2019-01-13 10:36

【摘要】：組織工程通過(guò)細(xì)胞與支架材料及可溶性因子的結(jié)合,旨在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為,重塑組織結(jié)構(gòu)和功能,為組織/器官修復(fù)再生提供了有效策略。細(xì)胞在支架材料中的粘附、增殖、表達(dá)與目標(biāo)組織相關(guān)的特異性功能等行為決定了最終組織工程產(chǎn)品的成功與否。在體內(nèi),細(xì)胞所處的微環(huán)境在調(diào)控細(xì)胞行為和組織維持/修復(fù)中發(fā)揮著重要作用,而微環(huán)境的主要組成之一就是細(xì)胞外基質(zhì)。因此,構(gòu)建組織工程支架材料及其表面化學(xué)特性,以模擬胞外基質(zhì)特性并獲得合適的細(xì)胞響應(yīng),成為組織工程研究的關(guān)鍵內(nèi)容之一。本質(zhì)上來(lái)講,胞外基質(zhì)的表面化學(xué)特性包涵兩方面：其一,化學(xué)成分自身所決定的性質(zhì),如親/疏水性、電荷特性和表面自由能等；其二,化學(xué)組份的濃度及時(shí)空分布。為了獲得特定的生物材料表面化學(xué)特性,將天然的胞外基質(zhì)組分或簡(jiǎn)單的化學(xué)基團(tuán)引入材料表面是最為行之有效的途徑和手段。本文選用聚己內(nèi)酯(poly(ε-caprolactone), PCL)和聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA)這兩種在組織工程中有著廣泛應(yīng)用的合成聚合物作為基底材料,分別通過(guò)引入簡(jiǎn)單化學(xué)基團(tuán)和共價(jià)結(jié)合Ⅰ型膠原,并輔以一系列體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),以探討材料的表面化學(xué)特性對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為未來(lái)設(shè)計(jì)和制備特定的組織工程支架材料、調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為并構(gòu)建更具功能的工程化組織提供科學(xué)指導(dǎo)。其中,通過(guò)在PCL分子中引入簡(jiǎn)單化學(xué)基團(tuán),成功構(gòu)建了具有不同表面化學(xué)性質(zhì)的PCL衍生聚合物薄膜,考察了間充質(zhì)干細(xì)胞在該系列表面的粘附、增殖和多向分化等行為,并對(duì)比了軟骨細(xì)胞表型維持、傳代軟骨細(xì)胞再分化以及間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化對(duì)表面化學(xué)性質(zhì)的特異需求。對(duì)于生物惰性的PHEMA材料,本文則采用膠原修飾的方法獲得了具有不同膠原密度的材料表面,并考察了間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖和多向分化行為與該化學(xué)成分密度的相關(guān)性。首先,本文采用開(kāi)環(huán)共聚法合成了一系列接有化學(xué)側(cè)基(氨基、甲基、羧基、羥基和羰基)的PCL衍生物(分別簡(jiǎn)稱(chēng)為PCL-NH2、PCL-CH3、PCL-COOH、PCL-OH和PCL-C=O),并在玻片表面旋涂形成薄膜。通過(guò)對(duì)薄膜表面潤(rùn)濕性、表面微觀形貌和血清蛋白吸附的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)親水基團(tuán)(包括-NH2、-COOH、-OH和-C=O)的修飾能夠降低PCL基材的疏水性,而-CH3的修飾無(wú)此影響；含有化學(xué)側(cè)基的聚合物在成膜過(guò)程中會(huì)形成島狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),并提高了薄膜表面的粗糙度；薄膜表面的血清蛋白吸附能力也與其親/疏水性呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)。然后,本文將人羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)接種于該系列PCL薄膜表面,考察了這些具有不同化學(xué)性質(zhì)的表面對(duì)細(xì)胞粘附、增殖和多向分化等生物學(xué)行為的影響。研究發(fā)現(xiàn),與未經(jīng)修飾的PCL相比,PCL-NH2、PCL-COOH、PCL-OH和PCL-C=O表面促進(jìn)了hAMSCs的粘附,具體表現(xiàn)在細(xì)胞鋪展面積、焦點(diǎn)黏著斑和胞外基質(zhì)蛋白分泌的增加,而其中的PCL-NH2和PCL-COOH薄膜表面還促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。hAMSCs在薄膜材料表面的分化行為也與基團(tuán)修飾引起的表面化學(xué)特性改變相關(guān),PCL-NH2表面支持較好的成骨分化,PCL和PCL-CH3有利于成脂肪分化,而成軟骨分化則在PCL-CH3和PCL-COOH薄膜表面更為顯著。以上述接有化學(xué)側(cè)基的PCL衍生聚合物薄膜為基礎(chǔ),本文進(jìn)一步考察了兔骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)、原代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(第一代,P1, rACs)和傳代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(P3和P5 rACs)的體外成軟骨能力。研究結(jié)果顯示,接有親水性基團(tuán)的薄膜表面(PCL-NH2、PCL-COOH、PCL-OH和PCL-C=O)能夠促進(jìn)這些細(xì)胞的粘附和增殖；在P1 rACs的長(zhǎng)期培養(yǎng)(21天)過(guò)程中,GAG/DNA值在PCL-COOH表面最高,而細(xì)胞在PCL和PCL-CH3表面出現(xiàn)了明顯的去分化現(xiàn)象,不但GAG/DNA值較低,而且細(xì)胞形態(tài)也從圓形向成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變；P3 rACs在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中能夠重獲軟骨表型,而rBMSCs和P5 rACs則在細(xì)胞粘附相對(duì)較弱的PCL和PCL-CH3表面才表現(xiàn)出較好的成軟骨分化效果,但分化水平仍遠(yuǎn)低于再分化的P3 rACs。這些結(jié)果說(shuō)明,間充質(zhì)干細(xì)胞的分化趨向和細(xì)胞種類(lèi)對(duì)材料的表面化學(xué)特性都具有特殊的需求,因此,根據(jù)特定的細(xì)胞來(lái)源和組織類(lèi)型來(lái)設(shè)計(jì)和制備合適的材料及其表面化學(xué)特性,才能成功構(gòu)建特定的工程化組織。最后,本文利用1,1羰二咪唑(CDI)作為中間交聯(lián)劑和不同濃度的Ⅰ型膠原溶液在PHEMA材料表面構(gòu)建出一系列具有不同膠原密度的表面,并考察了人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)對(duì)材料表面膠原密度的響應(yīng)。對(duì)材料表面進(jìn)行物化表征的結(jié)果表明,CDI處理降低了PHEMA表面的粗糙度和親水性,經(jīng)過(guò)膠原的修飾后,雖然粗糙度和表面形貌沒(méi)有明顯變化,但是材料表面的親水性卻隨著表面膠原的增多而升高。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PHEMA表面不具備細(xì)胞生長(zhǎng)的條件,而CDI處理和膠原的修飾則顯著促進(jìn)了細(xì)胞的粘附,且隨表面膠原的增多,細(xì)胞鋪展面積和增殖均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。高密度的膠原有利于hBMSCs勺成骨分化,而無(wú)膠原或低密度的膠原則促進(jìn)了細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化。但是,軟骨特異性胞外基質(zhì)的累積還因細(xì)胞來(lái)源而異,無(wú)膠原或膠原少的表面有利于綿羊膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(oACs)累積更多的粘多糖,而軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的hBMSCs則與此相反。綜上所述,本文通過(guò)成功構(gòu)建具有不同表面化學(xué)特征的PCL和PHEMA,利用包括間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞,開(kāi)展了對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖、多向分化以及功能維持等細(xì)胞行為的研究,探究了細(xì)胞對(duì)基材表面化學(xué)特性的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)基材表面化學(xué)性質(zhì)和化學(xué)信號(hào)的濃度對(duì)細(xì)胞行為均有調(diào)節(jié)作用,并揭示了不同細(xì)胞種類(lèi)對(duì)材料表面化學(xué)性質(zhì)的響應(yīng)具有特異性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2408351