【摘要】：研究背景間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有多向分化潛能(Multiple differentiation potentiality)的細(xì)胞。作為成體干細(xì)胞中最重要的一種,能夠向成骨、軟骨、肌細(xì)胞,以及神經(jīng)、脂肪細(xì)胞等方向分化,MSCs優(yōu)良的多向分化能力決定了其成為組織工程中重要的種子細(xì)胞來源。最新研究顯示,MSCs在骨損傷、脊髓損傷等組織修復(fù)和再生工程中均發(fā)揮重要作用。但針對細(xì)胞周圍微環(huán)境和支架材料的之間的作用關(guān)系,尤其是接觸界面剛度力學(xué)特性等調(diào)控MSCs生長、定向分化作用機(jī)理的相關(guān)研究并不完善。影響MSCs分化的因素中,除了生物化學(xué)等作用條件外,還包括傳導(dǎo)力學(xué)信號的生物物理因素。而利用仿生學(xué)原理從物理角度模擬特定的細(xì)胞微環(huán)境,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞修復(fù)、損傷組織快速更新,是近年組織工程學(xué)中的一個(gè)熱點(diǎn)。研究目的細(xì)胞接觸的界面其物理力學(xué)特性可對BMSCs的鋪展、遷移、增殖以及分化產(chǎn)生一定程度的作用。本文著重研究界面剛度對MSCs增殖及成骨分化的影響,通過選取一定范圍的剛度數(shù)值,制備剛度不同的聚丙烯酰胺水凝膠,表面修飾后獲得最大化仿生組織細(xì)胞外基質(zhì)的界面。繼而在界面上培養(yǎng)BMSCs并觀察其鋪展生長狀態(tài),檢測其成骨分化相關(guān)指標(biāo)和關(guān)鍵信號通路蛋白的表達(dá)差異,探討組織界面剛度變化對BMSCs生長、成骨分化的影響。以期從分子生物學(xué)角度驗(yàn)證剛度作為一個(gè)獨(dú)立因素的成骨誘導(dǎo)能力,為后續(xù)深入研究干細(xì)胞對剛度的響應(yīng)機(jī)制、剛度調(diào)控細(xì)胞分化的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)。研究方法1. BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)體系無菌條件下,取4周齡SD大鼠的后肢長骨并以10%FBS、DF-12完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)費(fèi)聯(lián)合差速消化法培養(yǎng)、傳代后得到BMSCs。體外擴(kuò)增培養(yǎng)。選取P1-P4代BMSCs染色觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)；平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察P1、P2、P4代的BMSCs其自我更新能力,觀察不同時(shí)間點(diǎn)位BMSCs的生長,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長曲線。利用小鼠抗大鼠單克隆抗體FITC-anti-Mouse/Rat CD 44、PE-anti-Mouse/Rat CD45、APC--anti-Mouse/RatCD90,分別通過免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定P2代BMSCs表面分子標(biāo)志。2.不同剛度聚丙烯酰胺水凝膠(PA膠)的制備及表面修飾處理對凝膠載體培養(yǎng)皿和蓋玻片化學(xué)處理,通過改變Acrylamide、Bis-Acrylamide配比組份,獲得不同剛度的聚丙烯酰胺水凝膠(PA膠),紫外線照射下,在膠面上化學(xué)交聯(lián)Collagen I、Fibronectin聯(lián)合涂被。蛋白修飾后的PA膠模擬組織界面剛度,仿生細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境,并具備實(shí)驗(yàn)需求的剛度數(shù)值。3.不同剛度PA膠界面上的細(xì)胞行為觀察選擇適宜的P2、P3代細(xì)胞,分別在不同剛度的PA膠界面上接種培養(yǎng),種植密度為1000個(gè)/100μL,以10%FBS、 DF-12完全培養(yǎng)基。PA膠分按剛度梯度分組。剛度區(qū)間選擇1-80Kpa,分為A組(4kpa)、B組(10kpa)、C組(40kpa)、D組(80kpa)、E組(1kpa)和普通培養(yǎng)皿對照組(極限剛度)進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)。倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)位各組細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞鋪展面積,對不同時(shí)間點(diǎn)位細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制BMSCs生長曲線。免疫熒光觀察P3代BMSCs細(xì)胞骨架、骨橋蛋白和骨鈣素。對蛋白修飾后的PA膠環(huán)境進(jìn)行CCK8毒理學(xué)測試。4.不同剛度PA膠界面上的細(xì)胞成骨行為的觀察選取A組(4kpa)、B組(10kpa)、C組(40kpa)作為低、中、高剛度對比,與普通培養(yǎng)皿對照組共4個(gè)分組同時(shí)接種P2代BMSCs,觀察界面上BMSCs成骨分化能力。茜素紅染色法檢測細(xì)胞成骨分化鈣沉積狀況；試劑盒檢測堿性磷酸酶ALP濃度。ELISA檢測BGP(骨鈣素)、PICP(C-端1型前膠原)兩個(gè)成骨分化指標(biāo),間接了解I型膠原合成速率。熒光定量技術(shù)PCR(FQ-PCR)檢測BGP、Runx2、Collal的mRNA在不同剛度培養(yǎng)體系中的水平。Western blot檢測F-actin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平。探討剛度差異對BMSCs成骨分化的影響,優(yōu)選適宜成骨分化的剛度區(qū)間。結(jié)果1.P1-P4代的BMSCs培養(yǎng)48h后細(xì)胞集落增大增多,總體細(xì)胞密度較前呈倍數(shù)增長,培養(yǎng)72h后細(xì)胞呈現(xiàn)典型的紡錘體樣外觀,較多的貼壁細(xì)胞相互靠近融合,放射狀或旋渦狀。生長曲線呈現(xiàn)S形,與Logistic生長曲線相符合。所有體外培養(yǎng)的BMSCs均有停滯期、快速增長期、平臺期。P1、P2、P4代的BMSCs克隆形成路分別為10.4%,9.7%和8.2%。P2代BMSCs的熒光免疫檢測顯示：CD90、CD44呈陽性表達(dá),CD45為陰性熒光著色,流式細(xì)胞術(shù)檢測P2代BMSCs表面分子標(biāo)志顯示：CD45-PE、CD44-FITC、CD90-APC表達(dá)率分別為1.65%、94.1%和95.8%。符合間充質(zhì)干細(xì)胞的典型生物學(xué)特征,培養(yǎng)體系中細(xì)胞顯示了良好的生長增殖態(tài)勢。2.不同剛度PA膠界面上P2代BMSCs生長曲線顯示：接種密度為1000個(gè)/100μL的條件下,在低剛度的PA膠界面上(1Kpa), BMSCs的增殖生長較普通培養(yǎng)皿對照組受到抑制,高剛度的PA膠界面(40、80Kpa)對BMSCs的增殖較普通培養(yǎng)皿對照組有一點(diǎn)促進(jìn)作用；密度為5×106/ml條件下,B(10Kpa)和C(40Kpa)兩種不同剛度的界面上,BMSCs除第一個(gè)24h的緩慢生長期外,生長均較對照組和A (4Kpa)組快,差異均具有顯著性。結(jié)合毒理性測試可知：一定剛度范圍內(nèi),隨著界面剛度數(shù)值的增加,BMSCs的生長增殖呈現(xiàn)更加良好的態(tài)勢。光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示：隨著界面剛度的提升,細(xì)胞鋪展形態(tài)隨之增大,低剛度界面(1Kpa)上的典型細(xì)胞鋪展面積只有高剛度界面(80Kpa)上的約38.8%。不同剛度PA膠界面的培養(yǎng)體系中,BMSCs細(xì)胞骨架典型且隨細(xì)胞縱向走行,普遍可見細(xì)胞骨橋蛋白和骨鈣素陽性表達(dá),顯示了在仿生的凝膠體系中,生長的BMSCs均具有較好的成骨分化能力3.高中低剛度A組(4kpa)、B組(10kpa)、C組(40kpa)的PA膠界面上,接種密度為1000個(gè)/100μL條件下,BMSCs均有成骨分化的趨勢。WB實(shí)驗(yàn)中隨著剛度提升,鈣粘蛋白E-cadherin表達(dá)升高,而肌動(dòng)蛋白(actin)表達(dá)無明顯差異,提示隨著界面剛度的增加,細(xì)胞鋪展、遷移相關(guān)的鈣粘蛋白表達(dá)降低,高剛度可促進(jìn)細(xì)胞粘附。低密度培養(yǎng)時(shí),指標(biāo)ALP和BGP的水平在高剛度上明顯升高。標(biāo)志基因ALP、Collα1和Runx2的mRNA水平在隨著界面剛度的提升逐漸增強(qiáng),與ELISA檢測結(jié)果基本類似,提示在一定范圍剛度內(nèi),剛度數(shù)值較大的界面可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。結(jié)論1.使用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)聯(lián)合差速消化法,可在短期內(nèi)較穩(wěn)定地獲得生長狀態(tài)良好、增殖能力強(qiáng)、純度較高的SD大鼠BMSCs。2.通過改變Acrylamide和Bis-acrylamide的濃度配比,可獲得0.1kPa～80 kPa的不同彈性剛度的界面,表面修飾蛋白Collagen I、Fibronectin后能較好的模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境,有利于細(xì)胞的粘附和鋪展。3. BMSCs的鋪展面積隨著界面剛度的提升而增加,實(shí)驗(yàn)組中低剛度界面上BMSCs鋪展面積只有高剛度界面上的約38.8%。在低剛度的PA膠界面上(1Kpa), BMSCs的增殖生長較普通培養(yǎng)皿受到抑制；高剛度的PA膠界面(40、80Kpa)對BMSCs的增殖有一定促進(jìn)作用,細(xì)胞行為因所依附的界面剛度不同而存在較大差異。4.單純的物理性質(zhì)改變能夠一定程度上誘導(dǎo)BMSCs成骨分化,本實(shí)驗(yàn)的4-80kpa剛度范圍內(nèi),成骨分化程度越高隨著界面剛度的提升而增加；而10-40kpa剛度區(qū)間對BMSCs成骨分化均有促進(jìn)作用。剛度作為一個(gè)物理因素可能通過參與WNT/β-Catenin、MAPKs信號通路而調(diào)控BMSCs的成骨分化。
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【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 Jan Henkel;Maria A.Woodruff;Devakara R.Epari;Roland Steck;Vaida Glatt;Ian C.Dickinson;Peter F.M.Choong;Michael A.Schuetz;Dietmar W.Hutmacher;;Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions  A 21st Century Perspective[J];Bone Research;2013年03期

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本文編號：2377219