【摘要】：摘要：基因治療是惡性腫瘤等重大疾病治療的最新策略,基因載體是基因治療的關(guān)鍵技術(shù)之一,但現(xiàn)有的病毒型載體安全性和非病毒型載體低效率嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。羥基磷灰石(HAP)是人體骨骼的主要成分,具有天然的生物相容性,與蛋白和基因有高親和性,且HAP納米顆粒本身對(duì)癌細(xì)胞具有抑制性能。前期研究顯示HAP納米顆粒是一種極具應(yīng)用潛力的基因載體材料,但需要進(jìn)一步提高其基因轉(zhuǎn)染效能,并闡明其細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其與載體微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。 本論文選擇了一種水熱合成法制備的稀土金屬摻雜的精氨酸表面修飾羥基磷灰石(HAP/Arg)納米顆粒為研究對(duì)象,闡明HAP/Arg納米顆粒的基因負(fù)載與釋放機(jī)理,并將其作用于體外培養(yǎng)的人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞Hela細(xì)胞,考察HAP/Arg納米顆粒的負(fù)載基因的轉(zhuǎn)染活性和生物安全性,實(shí)時(shí)觀察HAP/Arg納米顆粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入胞過程,并闡釋與細(xì)胞相互作用的入胞機(jī)制。主要內(nèi)容及結(jié)論歸納如下： 1)以HAP納米顆粒液相可控合成及其功能化研究為基礎(chǔ),水熱法制備了結(jié)晶程度比較高、晶形完整的HAP/Arg納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn),精氨酸修飾的HAP納米顆粒與沒添加精氨酸合成的HAP納米顆粒在結(jié)構(gòu)上基本一致。但精氨酸的加入在一定程度上抑制了HAP納米顆粒的生長(zhǎng)速率,與沒添加精氨酸合成的HAP納米顆粒相比,其長(zhǎng)徑比有所減小,呈短棒狀,表面電荷由荷負(fù)電轉(zhuǎn)為荷正電。從而為提高HAP納米顆粒的基因轉(zhuǎn)染效能奠定了基礎(chǔ)。其次,少量稀土離子Eu或Tb摻雜不影響合成的HAP/Arg納米顆粒產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),均為單一的HAP納米顆粒物相,在相應(yīng)可見光波段范圍內(nèi)均有發(fā)射特征峰,激發(fā)后分別可發(fā)出較強(qiáng)的特征紅光和綠光,從而使HAP/Arg納米顆粒具有發(fā)射熒光性能。 2)闡明了HAP/Arg納米顆粒的基因負(fù)載與釋放機(jī)理。結(jié)果表明,荷正電的HAP/Arg納米顆粒與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA通過靜電結(jié)合能快速形成HAP/Arg-DNA復(fù)合物,且30μg的HAP/Arg納米顆粒至少能結(jié)合1μg DNA。同時(shí),HAP/Arg納米顆粒對(duì)結(jié)合的DNA有明顯的保護(hù)作用,可免受人體血漿蛋白成分或核酸酶的破壞,從而提高了其轉(zhuǎn)載DNA的體內(nèi)穩(wěn)定性,為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染創(chuàng)造了良好條件。 3)考察了HAP/Arg納米顆粒的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染活性和生物安全性。研究發(fā)現(xiàn),HAP/Arg-DNA復(fù)合物可以有效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,而未經(jīng)精氨酸修飾的HAP納米顆粒不能有效轉(zhuǎn)載質(zhì)粒DNA,對(duì)Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率極低。HAP/Arg納米顆粒各劑量組在不同作用時(shí)間下對(duì)所選擇的人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞(Hela)的正常生長(zhǎng)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均無明顯影響。動(dòng)物的急性毒性實(shí)驗(yàn)和生殖毒性實(shí)驗(yàn)表明,HAP/Arg納米顆粒各劑量組與對(duì)照組相比均無顯著差異。以上結(jié)果為下一步構(gòu)建一種能高效、安全、簡(jiǎn)便的新型納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。 4)實(shí)時(shí)觀察HAP/Arg納米顆粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入胞過程,并闡釋了其內(nèi)吞入胞作用機(jī)制。研究表明,鋱摻雜的HAP/Arg納米顆粒被人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)攝取后主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,而且大部分分布在細(xì)胞核區(qū)域周圍。并且,HAP/Arg納米顆粒的入胞過程具有時(shí)間和濃度依賴性,作用時(shí)間以4h為宜,納米顆粒的濃度以50μg/mL為最佳。入胞競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明精氨酸修飾的HAP納米顆粒入胞量明顯強(qiáng)于未經(jīng)精氨酸修飾的HAP納米顆粒,這很可能與精氨酸及其胍基官能團(tuán)的作用有關(guān)。內(nèi)吞抑制試驗(yàn)結(jié)果表明HAP/Arg納米顆粒進(jìn)入HUVEC細(xì)胞是一個(gè)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的能量依賴的過程,并為網(wǎng)格蛋白和小凹蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞相結(jié)合的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,但以小凹蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑為主。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2285137