【摘要】：研究背景 組織工程技術(shù)是近來學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn),細(xì)胞療法和基因療法是組織工程研究的熱點(diǎn),學(xué)術(shù)界一直探求一種臨床實(shí)用性強(qiáng)的安全的輔助組織工程手段。 近年來,隨著脂肪抽吸術(shù)的廣泛開展和應(yīng)用,自體脂肪顆粒注射移植術(shù)已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛的重視。自體脂肪顆粒以其無(wú)排斥、感染率低、注射后組織相容性好等優(yōu)點(diǎn),是目前修復(fù)軟組織缺損比較理性的填充材料。雖然脂肪組織工程技術(shù)理論的發(fā)展,為真正實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)軟組織缺損和真正意義上形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。但是,脂肪組織工程技術(shù)目前還不能實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用,所以目前修復(fù)軟組織缺損較理想的填充材料是自體脂肪顆粒。 自體脂肪顆粒移植在臨床上一直備受關(guān)注,尤其是負(fù)壓抽脂術(shù)在臨床上得到廣泛的應(yīng)用之后,這種移植術(shù)被越來越多的臨床醫(yī)生和患者所接受,并在獲取、純化、注射脂肪和提高其存活率等方面不斷得到提高。但是,自體脂肪顆粒移植后吸收率可高達(dá)30%-50%,這種高吸收率的問題一直不能得到良好的解決,所以移植脂肪成活率較低極大地限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。脂肪組織不僅是儲(chǔ)存能量及內(nèi)分泌器官,還是軟組織填充理想的替代物,而且還被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的有效來源,因?yàn)橹窘M織當(dāng)中含有多種細(xì)胞成分,包括祖細(xì)胞成分,這些祖細(xì)胞成分可分化成為其他細(xì)胞系。脂肪組織當(dāng)中主要包含脂肪細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、壁細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分等,其中脂肪細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞是近年來研究的熱點(diǎn)。脂肪干細(xì)胞被認(rèn)為是一種表現(xiàn)脂肪細(xì)胞和血管細(xì)胞的祖細(xì)胞,它位于脂肪細(xì)胞之間、血管周圍或細(xì)胞外基質(zhì)中,可促進(jìn)脂肪組織的轉(zhuǎn)歸。脂肪干細(xì)胞存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中(stromal vascular fraction,SVF),而SVF是干細(xì)胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化,從脂肪組織中分離的多種細(xì)胞混合物形成的細(xì)胞團(tuán)就叫做間質(zhì)血管碎片(SVF)。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞,可分化為多種譜系,是再生醫(yī)學(xué)、組織工程等最理想的種子細(xì)胞。 選擇合適細(xì)胞外基質(zhì)支架,作為妥當(dāng)?shù)募?xì)胞載體是組織工程的關(guān)鍵,是使SVFs中的ADSCs得以增殖、分化的重要條件。脂肪組織本身含有非常豐富的膠原、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白等,這些組織是優(yōu)秀的細(xì)胞外基質(zhì)。這些年來熱門的SVFs細(xì)胞輔助脂肪轉(zhuǎn)移技術(shù),既解決了移植脂肪中ADSCs含量低,同時(shí)又解決了移植的SVFs缺乏細(xì)胞外基質(zhì)兩個(gè)問題,并簡(jiǎn)化了SVFs提取的體外培養(yǎng)、多次離心重懸等步驟,為臨床上解決移植脂肪吸收率高的難題提供了一種解決方法。 在組織工程材料中加入有活性的生長(zhǎng)因子,能夠增強(qiáng)工程化組織的血管化,減少吸收率,提高移植組織的成活。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)又稱為血管滲透因子,這種細(xì)胞因子具有促進(jìn)血管滲透的作用,同時(shí)還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、延長(zhǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命、促進(jìn)血管形成、增強(qiáng)血管通透性和改變細(xì)胞外基質(zhì)等作用。除了對(duì)血管的作用,它還與創(chuàng)面愈合、創(chuàng)傷組織修復(fù)、炎癥和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。VEGF與VEGF受體之間存在正反饋,VEGF因子局部應(yīng)用可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及其受體的高表達(dá),導(dǎo)致VEGF效應(yīng)的放大。但是VEGF在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)因其半衰期短、容易降解等因素使得不能充分發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。藥劑學(xué)的緩釋技術(shù)很好的解決這一難題,它通過微球包埋技術(shù)將VEGF包埋于聚乳酸納米微球中,從而使這種細(xì)胞因子能夠緩慢的釋放,達(dá)到對(duì)周圍環(huán)境持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的目的。這種緩釋技術(shù)在脂肪組織工程的研究領(lǐng)域具有很大的研究?jī)r(jià)值。 近年來,組織工程技術(shù)的發(fā)展迅速,使得很多臨床上的難題獲得了一種可能性的解決方案。然而,由于組織工程的血管化問題難以解決,大部分的組織工程技術(shù)距離臨床應(yīng)用還有很大距離。膠原蛋白是良好的支架材料,其已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為人工皮膚材料。對(duì)于種子細(xì)胞的選擇,大部分研究都選擇脂肪干細(xì)胞。然而由于脂肪干細(xì)胞需要培養(yǎng)周期,且操作復(fù)雜,臨床應(yīng)用性不強(qiáng)。SVFs作為種子細(xì)胞,具有很多優(yōu)勢(shì)。以膠原蛋白作為支架材料,以SVFs作為種子細(xì)胞構(gòu)建工程化的脂肪組織,并且以VEGF-PLA緩釋微球作為微環(huán)境細(xì)胞因子,國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。 研究目的 1.臨床指導(dǎo)上：希望通過探討VEGF-PLA納米緩釋微球與SVFs對(duì)游離移植脂肪顆粒及脂肪組織工程膠原支架血管化的影響。探索一種臨床應(yīng)用性強(qiáng)的輔助脂肪移植和脂肪組織工程的細(xì)胞療法和基因療法手段。為下一步將科學(xué)研究應(yīng)用于臨床做好理論基礎(chǔ)。 2.學(xué)術(shù)上：基因療法的細(xì)胞因子緩釋系統(tǒng)結(jié)合SVFs細(xì)胞療法對(duì)游離脂肪移植及組織工程膠原支架血管化的研究,在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界尚未見報(bào)道。本研究希望通過對(duì)其機(jī)理的探討,進(jìn)一步揭示其機(jī)理,為臨床應(yīng)用做鋪墊。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是,將SVFs與細(xì)胞因子緩釋系統(tǒng)相結(jié)合,聯(lián)合SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)構(gòu)建工程化脂肪組織及輔助脂肪移植。同類的研究在學(xué)術(shù)界尚未見報(bào)道。具體的研究目的如下。 1.利用酶消化法從人脂肪組織當(dāng)中分離提取SVFs,進(jìn)行形態(tài)觀察,并進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化,探討其干細(xì)胞特性及作為脂肪組織工程理想種子細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。 2.體外DiI熒光標(biāo)記SVFs,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記情況并檢測(cè)DiI標(biāo)記對(duì)SVFs培養(yǎng)貼壁所得PO代細(xì)胞增殖和成脂分化的影響,探討DiI標(biāo)記作為細(xì)胞示蹤標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)。 3.體外構(gòu)建VEGF-PLA聚乳酸納米微球緩釋系統(tǒng),檢測(cè)樣品包封率和載藥量,并檢測(cè)其體外緩釋能力,探討其應(yīng)用于輔助脂肪顆粒移植研究的可行性。 4.設(shè)計(jì)對(duì)照組,將SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合脂肪顆粒移植進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探討SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球?qū)w內(nèi)脂肪顆粒移植成活的影響。 5.以Ⅰ型膠原固態(tài)支架為載體材料,聯(lián)合SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)構(gòu)建工程化脂肪組織的影響,檢測(cè)其體內(nèi)構(gòu)建脂肪組織的血管化水平,為脂肪組織工程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 1.SVFs的體外分離培養(yǎng)及其培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化鑒定 收集抽脂術(shù)患者的脂肪組織,純化后用Ⅰ型膠原酶消化、過濾、離心、鋪皿進(jìn)行貼壁培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。用MTT法繪制細(xì)胞增殖生長(zhǎng)曲線;用相應(yīng)的定向誘導(dǎo)液對(duì)SVFs培養(yǎng)所得未傳代PO代細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化,并用油紅O、茜素紅和阿新藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。 2. SVFs體外DiI熒光標(biāo)記及觀察標(biāo)記物對(duì)SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞生物性狀的影響 熒光染料DiI體外標(biāo)記SVFs,倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,分別用MTT法和油紅O定量檢測(cè)法檢測(cè)DiI標(biāo)記后SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞增殖能力和成脂分化能力,并與未標(biāo)記組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,分析標(biāo)記后細(xì)胞生物性狀的改變。 3.體外構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球并檢測(cè)其載藥量、包封率及體外緩釋特性 體外用超聲乳化法構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球,檢測(cè)微球載藥量和包封率；透射電鏡觀察微球包被情況并測(cè)量直徑；用ELISA試劑盒檢測(cè)VEGF-PLA緩釋能力,連續(xù)檢測(cè)21d,分析緩釋微球的特性,為下一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。 4.SVFs及VEGF-PLA緩釋微球?qū)χ绢w粒移植影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 分組設(shè)計(jì)：第1組移植單純脂肪顆粒；第2組移植脂肪顆粒+SVFs,第3組移植脂肪顆粒+SVFs+VEGF-PLA緩釋微球；體外將SVFs用DiI熒光標(biāo)記,標(biāo)記后分別按照分組將SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球與脂肪顆�；靹�,觀察混勻后的性狀,無(wú)菌條件下將混合物通過注射的方式隨機(jī)注射入裸鼠皮下,每只裸鼠注射3個(gè)點(diǎn)。8w后取出移植物,準(zhǔn)確測(cè)量濕重,記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,組織切片經(jīng)HE和CD34及VEGF免疫組化染色分析,觀察移植后脂肪顆粒存活情況,并觀察CD34和VEGF的表達(dá)情況,顯微鏡下計(jì)數(shù)三組毛細(xì)血管數(shù)量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,分析SVFs和VEGF-PLA緩釋微球?qū)σ浦参镅芑挠绊憽?5.VEGF-PLA緩釋微球促進(jìn)工程化脂肪組織血管化的影響研究 準(zhǔn)備三組移植物,1組為SVFs+膠原支架,未體外成脂誘導(dǎo)。2組為SVFs+膠原支架,3組為SVFs+膠原支架+VEGF-PLA緩釋微球,2組和3組體外成脂誘導(dǎo)3天后進(jìn)行裸鼠體內(nèi)移植,三組移植同一只裸鼠皮下；分別于4w后取出新生標(biāo)本,通過大體觀察、測(cè)量濕重、HE染色觀察新生組織結(jié)構(gòu)和血管生長(zhǎng)情況,高倍鏡下計(jì)數(shù)新生毛細(xì)血管密度,收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SVFs培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)曲線(OD值)采用曲線擬合方法分析。DiI標(biāo)記對(duì)細(xì)胞增殖能力影響采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。DiI標(biāo)記后對(duì)SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞成脂能力影響采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。透射電鏡和圓二色譜法測(cè)緩釋微球直徑的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。體內(nèi)脂肪移植物濕重比較采用單因素方差分析。體內(nèi)脂肪移植物血管數(shù)比較采用單因素方差分析。組織工程新生物濕重比較采用單因素方差分析。組織工程新生物血管數(shù)比較比較采用單因素方差分析。結(jié)果 1.從抽脂術(shù)患者得到的脂肪組織當(dāng)中成功分離得到SVFs,貼壁生長(zhǎng)后形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞,具有很強(qiáng)的分裂增殖能力,3至7天時(shí)細(xì)胞增殖快速。對(duì)所測(cè)的OD值進(jìn)行曲線擬合方法分析,用Quadratic模型,R2=0.965,回歸方程檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=503.047,P=0.000)。用成脂、成骨、成軟骨定向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2～3周后,分別用油紅O、茜素紅、阿新藍(lán)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。 2.體外用DiI成功標(biāo)記SVFs,標(biāo)記后細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光,標(biāo)記率較高,標(biāo)記后細(xì)胞成活率較高,達(dá)(92.31±1.52)%。與正常的SVFs成活率(92.73±0.57)%并無(wú)差異。兩組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。經(jīng)方差齊性分析,兩組樣本的方差不齊(F=5.396,P=0.043)。兩個(gè)樣本之間的均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.631,P=0.550),DiI標(biāo)記對(duì)SVF細(xì)胞成活率無(wú)影響。 對(duì)OD值進(jìn)行重復(fù)測(cè)量分析。Mauchly's Test of sphericity檢驗(yàn)Mauchly'sW為0.001,P=0.018,7次測(cè)量的OD值存在相關(guān)性。Test of within subjects Effects(Greenhouse-Geisser校正)見時(shí)間因素P=0.000。時(shí)間和分組作用P=0.524,F=0.693�？梢姇r(shí)間因素的作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,測(cè)量指標(biāo)有隨時(shí)間變化而變化的趨勢(shì),而時(shí)間因素的作用不受分組因素影響。Test of Between-Subjects Effects分組作用的F=0.062,P=0.810,可見分組因素不起作用,兩組無(wú)區(qū)別。每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)DiI標(biāo)記組和未標(biāo)記組OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(每個(gè)點(diǎn)P0.05詳見表2-2)。重復(fù)測(cè)量分析兩組OD均數(shù)變化趨勢(shì),2組幾乎重疊(詳見圖2-3)以上的分析結(jié)果可見DiI標(biāo)記對(duì)SVFs貼壁培養(yǎng)的PO代細(xì)胞增值能力無(wú)影響。DiI標(biāo)記后對(duì)SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞成脂能力也沒有太大的影響,兩組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。經(jīng)方差齊性分析,兩組樣本的方差齊(F=0.794,P=0.399)。兩個(gè)樣本之間的均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.562,P=0.157),DiI標(biāo)記對(duì)SVF細(xì)胞成活率無(wú)影響。 3.體外成功構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球,微球表面光滑、球體大小均勻、形態(tài)飽滿；微球直徑平均為(27.56±4.60)nm；微球樣品包封率為(89.24±1.24)%,計(jì)算樣品的載藥量為：{(17.85±0.25)×10-3}%；通過ELISA方法檢測(cè)微球緩釋特性,21d內(nèi)微球可緩慢釋放VEGF,第21d累計(jì)釋藥率為80.35%。將微球稀釋后在透射電鏡下測(cè)量其直徑為(28.30±4.64)nm。與利用圓二色譜法測(cè)量微球直徑法比較。兩組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。經(jīng)方差齊性分析,兩組樣本的方差齊(F=0.033,P=0.860)。兩個(gè)樣本之間的均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.253,P=0.253),兩種測(cè)量方法無(wú)差異。 4.將3組混合物移植裸鼠體內(nèi)8w后,裸鼠全部成活,移植物清晰可見。1組、2組和3組平均濕重分別為：(0.077±0.119)g；(0.159±0.016)g；(0.182±0.120)g。3組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗(yàn),P=0.946,方差具有齊性。3組數(shù)據(jù)有顯著性差異,3組間比較,F=167.678,P=0.000,3組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第3組濕重高于第2組(P=0.001)。第2組濕重高于第1組(P=0.000)組織切片HE染色顯示第3組脂肪細(xì)胞成活率最高,纖維性成分最少,第2組次之,第1組內(nèi)部纖維性成分最多；免疫組化結(jié)果同樣是第3組表達(dá)最強(qiáng),第2組次之,第1組最少。血管密度計(jì)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析,第1、2、3組平均新生血管數(shù)量分別為：(7.25±1.83)個(gè)/HP;(12.65±1.69)個(gè)/HP；(14.75±2.02)個(gè)/HP；3組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗(yàn),Levene statistic為0.256,P=0.775,方差具有齊性。組間比較,F=87.048,P=0.000,3組數(shù)據(jù)有顯著性差異。第3組血管數(shù)多于第2組(P=0.000)。第2組血管數(shù)多于第1組(P=0.001)。 5.三組移植物移植裸鼠體內(nèi)4w后,動(dòng)物全部成活,第2組和第3組成功構(gòu)建出脂肪組織。新生物濕重測(cè)定,術(shù)后4w時(shí)三組濕重分別為：(23.28±3.86)mg,(31.16±2.19)mg,(36.67±1.60)mg,運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析,首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),Levene statistic為3.044,P=0.069,方差具有齊性。三組濕重比較,差異具有顯著性(F=48.768,P=0.000)。1組比2組輕,差異具有顯著性(P=0.000)。2組比3組輕,差異具有顯著性(P=0.001)。4w時(shí)第1組、2組和3組新生毛細(xì)血管密度平均分別為(1.81±0.83)個(gè)/HP,(2.62±0.89)個(gè)／HP,(3.44±1.09)個(gè)/HP。Levene statistic檢驗(yàn),方差具有齊性(P=0.318)。Levene statistic為1.177,方差具有齊性(P=0.318)。三組比較F=11.846,差異具有顯著性(P=0.000)。1組比2組血管少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。2組比3組血管少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。可見VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合SVFs能夠明顯促進(jìn)膠原支架體內(nèi)成脂和血管化水平。 結(jié)論 1.抽脂術(shù)獲得的脂肪組織能夠成功分離提取大量的多能干細(xì)胞,經(jīng)形態(tài)學(xué)、及多向分化鑒定證實(shí)為干細(xì)胞成分。該細(xì)胞容易獲取、來源豐富、在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下能夠分化成為目的細(xì)胞,可作為脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞。 2.DiI標(biāo)記是一種較好的細(xì)胞示蹤方式,標(biāo)記后細(xì)胞成活率較高,不會(huì)影響SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞的增殖和成脂分化的能力。 3.將VEGF包被于PLA微球中,可以使微球中VEGF緩慢釋放進(jìn)入局部微環(huán)境,從而達(dá)到VEGF對(duì)周圍細(xì)胞持續(xù)發(fā)揮作用的目的。 4. SVFs和VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)能夠明顯促進(jìn)脂肪顆粒的成活率,同樣能夠明顯促進(jìn)脂肪顆粒移植血管化的水平,是一種輔助脂肪顆粒移植理想的種子細(xì)胞和細(xì)胞因子緩釋劑。 5.VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合SVFs體內(nèi)能夠明顯促進(jìn)新生組織的血管化,與膠原支架混合移植能夠構(gòu)建出成熟的脂肪組織。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R318.1

【參考文獻(xiàn)】

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8 孫慶仲 ,閆紅艷 ,李正維 ,孫慶智;自體顆粒脂肪移植術(shù)的進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志;2002年06期

9 戚可名;張晶;;顆粒脂肪注射移植操作體會(huì)[J];中華整形燒傷外科雜志;1994年06期

10 杜學(xué)亮,羅少軍,郝新光,湯少明,梁杰;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在顆粒脂肪移植后血運(yùn)重建過程的作用[J];中華整形外科雜志;2005年02期

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