本文選題：組織 + 工程�。� 參考：《中南大學》2012年博士論文

【摘要】：第一章UC-MSCs分化為角膜上皮細胞的實驗研究 目的：探討在體外條件下誘導UC-MSCs(臍帶間充質干細胞)分化為角膜上皮細胞的可行性。 方法：消化法分離培養(yǎng)UC-MSCs細胞,流式細胞技術檢測細胞表型、細胞周期,MTT檢測細胞生長增殖能力。將UC-MSCs在不同濃度的EGF (5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml)下培養(yǎng),觀察EGF能否誘導UC-MSCs分化為角膜上皮細胞。確定細胞分化的最佳時間。同時,將UC-MSCs與兔角膜上皮細胞共培養(yǎng),觀察分化情況,免疫組化檢測角膜上皮相關蛋白的表達。 結果：采用消化法可以在體外條件下成功地分離培養(yǎng)UC-MSCs,其表達CD29、CD34,細胞保持著較旺盛的增殖能力。在15ng/ml EGF處理30天的條件下,UC-MSCs可以部分表達角膜上皮細胞的標記K3；UC-MSCs在與角膜上皮細胞共培養(yǎng)2周后,UC-MSCs細胞可以檢測到K3、ABCG2與P63的部分表達。 結論：體外條件下,采用共培養(yǎng)的方法可以誘導UC-MSCs分化為角膜上皮細胞。 第二章利用核酸酶聯合低溫電泳制備脫細胞豬角膜基質 目的：探索使用核酸酶聯合低溫電泳制備的脫細胞豬角膜基質(Decellularized porcine corneal matrix, DPCM)作為生物角膜支架材料的可行性。 方法：去除豬角膜上皮與內皮細胞之后,使用17U/mL DNase Ⅰ處理正常豬角膜(Native porcine cornea,MPC),利用低溫電泳清除殘留的細胞與DNA碎片,制備DPCM,并對制備的DPCM進行相關的生物學與物理學特性的評價。主要有：檢測DPCM的大體形態(tài)、組織學特點、去細胞效率、DNA含量、蛋白多糖、超微結構的改變；檢測DPCM的透光率、生物相容性；DPCM浸提液對角膜上皮細胞、基質細胞、內皮細胞增殖活性的影響。 結果：通過核酸酶聯合低溫電泳的脫細胞方法可以成功去除NPC中96.43%的DNA成分,保留了92%的氨基葡聚糖成分；而且DPCM中膠原纖維的超微結構沒有發(fā)生明顯的變化；在300-800nnm波長范圍內,DPCM的透光率與NPC沒有顯著差異；DPCM保持了良好的生物力學特點；皮下移植試驗沒有觀察到炎癥細胞浸潤的現象；DPCM浸提液對角膜上皮細胞、基質細胞和內皮細胞的增殖活性沒有影響。 結論：使用核酸酶聯合低溫電泳的脫細胞方法有效地清除了細胞成分,良好地保存了角膜基質的精密超微結構,保留了膠原纖維的有序排列,儲備了92%的蛋白多糖成分。該方法脫細胞效率明顯,特異性強；DPCM具有高度的透明性、極低的免疫原性、良好的生物相容性、足夠的生物力學強度和長期的生物穩(wěn)定性。 第三章組織工程板層角膜的構建與體內移植 目的：利用DPCM為載體,為UC-MSCs提供生長的微環(huán)境,構建組織工程化板層角膜(Tissue engineering lamellar cornea,TELC),并評價其整體功能。 方法：將UC-MSCs接種在DPCM上,體外培養(yǎng)1、2、3周后,在各時間點取材對構建的TELC進行HE染色觀察其組織結構特點,透射電鏡檢測細胞連接形成的情況；免疫熒光檢測K3、ZO-1、Cadherin、integrinp4、LN、FN等蛋白的表達情況；通過新西蘭大白兔的體內板層角膜移植(lamellar keratoplasty, LKP)實驗,評價TELC的整體功能：植片上皮化時間、透明性、透光率、生物學相容性、術后愈合情況等。 結果：UC-MSCs可以在DPCM上生長,并被誘導分化為角膜上皮細胞。在體外構建過程中,12天可以形成具備3-4層上皮細胞的TELC。該材料上的細胞已經具備明顯的黏附、增殖和形成復層上皮的能力。體內移植后,DPCM組上皮化的時間大約為7+2天,完全透明的時間為30±5天。與DPCM組相比,TELC組術后第一天就達到了完全上皮化,熒光素鈉染色陰性,植片透明。在300-800nm波長范圍內,TELC組比DPCM組的透光率略有增強。 結論：利用UC-MSCs作為種子細胞,DPCM作為支架材料,可以成功構建具備生理功能的生物材料TELC;構建的TELC在體內條件下可以保持良好的生物相容性、良好的透明性與屏障功能。
[Abstract]:Chapter 1 : Experimental study on differentiation of UC - MSCs into corneal epithelial cells

Objective : To investigate the feasibility of inducing differentiation of UC - MSCs ( umbilical cord mesenchymal stem cells ) into corneal epithelial cells in vitro .

Methods : UC - MSCs were cultured under different concentrations of EGF ( 5 ng / ml , 10 ng / ml , 15 ng / ml ) and cultured under different concentrations of EGF ( 5 ng / ml , 10 ng / ml , 15 ng / ml ) .

Results : UC - MSCs can be successfully isolated and cultured in vitro under external conditions . The expression of CD29 , CD34 , and cells in vitro is higher than that in vitro . Under the condition of 15 ng / ml EGF treatment for 30 days , UC - MSCs can partially express the markers K3 of corneal epithelial cells .
The expression of K3 , ABCG2 and P63 could be detected by UC - MSCs after two weeks of co - culture with corneal epithelial cells .

Conclusion : In vitro , co - culture can induce the differentiation of UC - MSCs into corneal epithelial cells .

In chapter 2 , the acellular porcine corneal stroma was prepared by the combination of nuclease and low temperature electrophoresis .

Objective : To explore the feasibility of using the acellular porcine corneal stroma ( DPCM ) prepared by using nuclease in combination with low temperature electrophoresis .

Methods : After removal of corneal epithelium and endothelial cells of porcine cornea , the normal porcine cornea ( MPC ) was treated with 17U / mL DNase鈪，

本文編號：1893968