發(fā)布時間：2018-03-11 01:05

  本文選題：骨組織工程　切入點：脂肪來源干細胞　出處：《第三軍醫(yī)大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景： 骨缺損的修復一直是骨科臨床亟待解決的難題之一。近年來，隨著組織工程的空前發(fā)展，應用組織工程化骨修復骨缺損成為了研究熱點。骨的再生是一個多因素相互作用的復雜過程，這一過程中，許多生長因子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）與成骨誘導有著密切的關系。BMP家族成員中，，BMP2具有最高的成骨誘導活性，同時，研究表明，BMP7可以促進成骨細胞增殖和新骨形成。因此，我們推測共表達BMP2和BMP7可能更有利于ADSCs細胞向成骨細胞轉化以及轉化后細胞的增殖，從而在體內(nèi)更好地促進骨組織的生長和愈合。 目的： 以人工合成β-TCP鈣磷陶瓷為支架材料，復合BMP2與BMP7聯(lián)合基因修飾的大鼠脂肪來源干細胞(adipose derived stem cells,ADSCs)，研究構建組織工程骨的可行性。 方法： (1)大鼠的脂肪來源干細胞（ADSCs）的分離培養(yǎng)、體外擴增，以及細胞表面標志和分化潛能檢測。 (2)分別構建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的BMP2重組慢病毒表達質粒及攜帶紅色熒光蛋白(RFP)的BMP7的重組慢病毒表達質粒。以Lv-BMP2轉染ADSCs、Lv-BMP7轉染ADSCs和Lv-BMP2、Lv-BMP7共轉染ADSCs，另設未轉染ADSCs作為對照。并以Realtime PCR和Western blot檢測轉染后細胞中BMP2和BMP7基因的mRNA和蛋白表達情況。應用Western blot檢測轉染后14天各組細胞骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原的蛋白表達情況，并檢測各組堿性磷酸酶(ALP)的活性。 (3)體外培養(yǎng)BMP2與BMP7聯(lián)合基因修飾的ADSCs，并種植于β-TCP，進行體外復合培養(yǎng)。使用Picogreen染料定量細胞中的雙鏈DNA，監(jiān)測細胞增殖過程。采用ALP定量檢測細胞在材料內(nèi)表達ALP的情況。并通過茜素紅染色、熒光定量PCR檢測細胞與支架材料復合物的成骨活性。 (4)建立大鼠股骨缺損模型，按分組將細胞與支架材料復合物回植于股骨缺損處，回植后2、4、6周時X光拍照，同時組織學觀察體內(nèi)成骨情況。 結果： (1)分離的大鼠ADSCs在體外具有很強的增殖能力，表面抗原CD44、CD29表達呈陽性，CD45、CD34、CD11b表達呈陰性，并具有向成骨和成脂細胞分化潛能。 (2)慢病毒轉染后細胞中BMP2和BMP7基因可以高效穩(wěn)定表達。骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原的表達明顯升高，并且聯(lián)合轉染組最高。聯(lián)合轉染組的ALP活性也明顯高于單轉組。 (3) ADSCs經(jīng)BMP基因修飾后，雙鏈DNA定量分析發(fā)現(xiàn)各組細胞在支架材料上生長增殖良好。細胞接種到支架材料14天后，雙基因修飾組的ALP活性、鈣化以及ALP、OPN、OC基因表達均明顯高于單基因修飾組。 (4)裸鼠實驗中，X光和組織學檢測顯示，BMP2和BMP7雙基因修飾組及單基因修飾組都有新骨形成，但雙基因修飾組的成骨面積多于單基因修飾組(P0.01)。 結論： 通過慢病毒載體系統(tǒng)進行雙基因轉染的大鼠脂肪干細胞（ADSCs）復合支架材料β-TCP體外構建組織工程骨及體內(nèi)成骨的實驗研究，我們證實利用慢病毒載體系統(tǒng)可以實現(xiàn)ADSCs穩(wěn)定長期共表達hBMP2及hBMP7基因。此外，BMP2和BMP7雙基因共表達比單基因表達能夠更有效促進組織工程化骨的成骨效果。
[Abstract]:Background:
Repair of bone defect is one of the difficult problems to be solved in clinical department of orthopedics. In recent years, with the development of tissue engineering, application of tissue engineered bone to repair bone defects has become a research hotspot. The bone regeneration is a complex process of interaction of many factors, in this process, many growth factors play an important role among them, bone morphogenetic protein (Bone Morphogenetic, Proteins, BMPs) and osteogenic induction is closely related to the.BMP family members, BMP2 has the highest osteoinductive activity, at the same time, studies show that BMP7 can promote the proliferation of osteoblasts and new bone formation. Therefore, we hypothesized that CO expression of BMP2 and BMP7 may be more conducive to ADSCs cells into bone cells and transformed cell proliferation in vivo, so as to better promote bone tissue growth and healing.
Objective:
The feasibility of constructing tissue-engineered bone was studied by using synthetic beta -TCP calcium phosphate ceramic as scaffold material and adipose derived stem cells (ADSCs) combined with BMP2 and BMP7 gene modified genetically modified rat adipose derived stem cells.
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本文編號：1595872