本文選題：小腸黏膜下層　切入點：組織工程　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:角膜上皮的完整性是維持角膜透明及正常視功能的基礎(chǔ),其穩(wěn)定性依賴于角膜緣干細胞(Limbal Stem Cells,LSCs)的不斷增殖分化及向心性移動。眼表疾病(Stevens-Johnson綜合征、化學(xué)、熱、輻射損傷、廣泛的微生物感染)和遺傳性疾病(先天性無虹膜)可以引發(fā)嚴重或完全的角膜緣干細胞缺乏(Limbal Stem Cell Deficiency,LSCD)或功能障礙,進而導(dǎo)致角膜上皮缺損、進行性角膜結(jié)膜化、新生血管化、慢性炎癥、角膜渾濁、甚至失明。目前LSCs移植是治療LSCD及功能障礙的最主要方法,但自體LSCs取材有限,同種異體角膜供體來源嚴重匱乏及免疫排斥反應(yīng)等限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此,組織工程角膜上皮的構(gòu)建成為當(dāng)前的研究熱點,理想的支架材料是其構(gòu)建的關(guān)鍵要素。目的:應(yīng)用不同濃度的十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)脫細胞處理豬小腸黏膜下層(Small Intestine Submucosa,SIS),篩選制備脫細胞SIS的最佳濃度時間,并檢測其生物相容性及生物安全性,探討脫細胞SIS用于構(gòu)建組織工程角膜上皮載體的可行性。方法:配制濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%的SDS液體,分別脫細胞處理SIS 15min、30min、1h、2h(n=20),同時在脫細胞過程中觀察SIS的大體形態(tài)學(xué)變化,蘇木素-伊紅(Hematoxylin And Eosin,HE)和4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色組織學(xué)觀察脫細胞前后SIS的生物學(xué)特性,并對脫細胞后SIS支架行基因組DNA分析(n=5)以初步評價各種濃度時間SDS液體的脫細胞效果;將篩選的脫細胞效果徹底、組織學(xué)結(jié)構(gòu)保留完整的標本進行單軸拉伸實驗測定其生物力學(xué)性能,并以正常豬SIS作對照,篩選出機械力學(xué)性能良好的脫細胞標本。應(yīng)用上述篩選的脫細胞濃度時間處理SIS,并用掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy,SEM)、透射電鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)觀察脫細胞SIS的超微結(jié)構(gòu);ELISA實驗對生長因子含量進行定量分析;CCK-8檢測脫細胞SIS浸提液對兔角膜上皮細胞的細胞毒性;脫細胞SIS標本大鼠皮下埋植觀察免疫排斥反應(yīng);兔角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)植入脫細胞SIS植片及兔角膜上皮細胞接種在脫細胞SIS植片上的接種實驗驗證體內(nèi)及體外的生物相容性;細胞免疫熒光實驗檢測角膜上皮特異性標記物CK3的表達。結(jié)果:脫細胞SIS肉眼觀為乳白色、半透明的膜狀物、而且具有一定的彈性、韌性和透光性;HE和DAPI染色光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果顯示0.1%及0.2%濃度SDS處理30min時SIS支架材料無細胞、細胞碎片及DNA物質(zhì)殘留,膠原纖維排列規(guī)則、有序,組織大體結(jié)構(gòu)保留完整;基因組DNA檢測提示0.1%及0.2%濃度SDS處理30min的脫細胞SIS支架細胞及DNA成分去除徹底,脫細胞率可達90%以上;生物力學(xué)檢測:0.1%SDS處理30min組與正常SIS組比較,極限抗張強度無顯著性差異(P0.05),而0.2%SDS處理30min組與正常SIS組及0.1%SDS處理30min組比較均有顯著性差異(P0.05)。各組彈性模及斷裂伸長率(%)比較無顯著性差異(P0.05);SEM和TEM檢查脫細胞SIS膠原纖維排列整齊,纖維間孔隙率增加,超微結(jié)構(gòu)基本與正常SIS相似;脫細胞SIS生長因子含量與正常SIS相比無顯著性差異(P0.05);脫細胞SIS浸提液對兔角膜上皮細胞生長狀態(tài)無顯著影響;脫細胞SIS大鼠皮下埋植無明顯移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng);兔角膜基質(zhì)囊袋移植脫細胞SIS表現(xiàn)出良好的生物相容性;兔角膜上皮細胞在脫細胞SIS呈復(fù)層生長,相鄰細胞間存在緊密連接;角膜上皮CK3表達陽性。結(jié)論:0.1%SDS脫細胞處理30min是制備脫細胞豬SIS最為理想的濃度時間;脫細胞SIS有一定的機械力學(xué)性能、良好的生物相容性及生物安全性,具備構(gòu)建組織工程角膜上皮支架材料的可行性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08

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本文編號：1562923