本文選題：胰島移植　切入點(diǎn)：β細(xì)胞　出處：《浙江大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來,超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)或超小超順磁性氧化鐵納米顆粒(USPIO)良好的生物相容性及多能性得到廣大學(xué)者的普遍認(rèn)同,被越來越多地應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或者腫瘤,尤其是在進(jìn)行活體內(nèi)無創(chuàng)監(jiān)測示蹤方面。但自從美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的第一批商用SPIO產(chǎn)品Feridex?和Resovist?分別在2008年和2009年底停產(chǎn)以來,一直未有一種合適的能夠在臨床應(yīng)用的SPIO替代產(chǎn)品出現(xiàn)。在本研究中,我們研發(fā)了一種簡便的、以無毒性的水合無機(jī)鐵鹽作為納米材料鐵核心的前體替代過往相對劇毒的乙酰丙酮鐵的合成工藝。并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步用兩親性聚合物--羧基化的聚氧乙烯月桂醚(OE-PEG-COOH)對油性環(huán)境下合成的鐵核心進(jìn)行包被,制備了具有良好水溶性的USPIO納米顆粒,最后再用Bcl-2等單抗對其表面進(jìn)行功能化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí),這種新型的納米材料能夠有效的被β細(xì)胞內(nèi)吞,并在相對低鐵濃度下對原代胰島細(xì)胞進(jìn)行有效標(biāo)記。我們通過商用產(chǎn)品FeraSpin S對這種新型納米材料進(jìn)行了生物相容性以及細(xì)胞毒性的對比實(shí)驗(yàn)研究,并對其安全劑量范圍進(jìn)行了初步測定。進(jìn)一步的結(jié)果證實(shí),這種新型納米材料能夠有效地對體內(nèi)的移植胰島細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記示蹤,并在臨床3.0T MRI場強(qiáng)下清晰顯影。后續(xù)的普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)以及免疫組化實(shí)驗(yàn)亦對納米材料能夠有效標(biāo)記體內(nèi)胰島細(xì)胞予以進(jìn)一步證實(shí)。此外,值得一提的是,基于本合成路線,我們可以將末端Bcl-2功能化單抗替換成任意其他特異性的靶標(biāo)分子,合成新型的其他特異性USPIO探針,提高標(biāo)記特異性,例如Exendin-4-USPIO。以上結(jié)果均提示這種新型的功能化USPIO具有標(biāo)記示蹤胰島細(xì)胞或其他細(xì)胞的良好應(yīng)用前景。 第一部分Bcl-2功能化USPIO的制備及其表征 目的：自行研制無毒性兩親性聚合物表面修飾的USPIO,修飾親水末端基團(tuán)進(jìn)行Bcl-2單抗連接,并對制備的磁納米顆粒的結(jié)構(gòu)、形貌和理化性狀進(jìn)行表征。 方法：油性條件下采用無毒水合鐵鹽作為前體制備USPIO鐵核心,然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法對其進(jìn)行兩親性聚合物的包被增加水溶性。應(yīng)用酸化氧化法對親水端末端OH基團(tuán)改性為COOH基團(tuán),后續(xù)應(yīng)用NHS/EDC法與Bcl-2單抗相連制備功能化USPIO。并進(jìn)一步對制備的USPIO、Bcl-2-USPIO通過等離子發(fā)射光譜(ICP)、透射電子顯微鏡(TEM)、納米激光粒度儀(DLS)、振動樣品磁強(qiáng)計(MPMS)和磁共振成像系統(tǒng)(MR scanner)等方法對其理化性狀進(jìn)行研究。 結(jié)果：USPIO呈黑褐色,長時間放置不產(chǎn)生團(tuán)聚。TEM掃描提示USPIO顆粒核心直徑約為4～10nm,分布集中,大小均一,性質(zhì)穩(wěn)定,分散性好。經(jīng)兩親性聚合物包被后,納米激光粒度儀分析結(jié)果提示整體粒徑平均尺寸為28nm。C13質(zhì)譜測試,證實(shí)兩親性聚合物的羥基端成功改性為羧基,在163ppm處出現(xiàn)明顯峰值。制備的USPIO在室溫(300K)外磁場為2T時的磁滯回線提示制備的USPIO的飽和磁化強(qiáng)度為38emu/g,與商用產(chǎn)品Feridex41emu/g相當(dāng)。MRI顯示USPIO可以明顯縮短T1和T2弛豫時間,T2信號強(qiáng)度與樣品的Fe濃度正相關(guān)。 結(jié)論：成功制備出具有高分散性、強(qiáng)磁性、粒徑均勻的USPIO,3.0-T MRI顯示USPIO具備良好的超順磁性。 第二部分PEG-USPIO標(biāo)記胰島細(xì)胞系INS-1、beta-TC-6的細(xì)胞 生物學(xué)研究 目的：研究自制的USPIO體外標(biāo)記胰島細(xì)胞系的效率、以及對細(xì)胞活力和功能的影響,為后續(xù)胰島移植MRI活體示蹤奠定基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)胰島細(xì)胞系INS-1以及Beta-TC-6,使用USPIO分別標(biāo)記。采用普魯士蘭染色和細(xì)胞內(nèi)鐵濃度測定等方法觀察被標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒情況。利用梯度濃度USPIO標(biāo)記INS-1細(xì)胞,普魯士蘭染色檢測其標(biāo)記效率。采用四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)檢測USPIO標(biāo)記的INS-1細(xì)胞活力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀熒光檢測標(biāo)記后細(xì)胞的凋亡水平。采用葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)對標(biāo)記后Beta-TC-6細(xì)胞的胰島素分泌功能進(jìn)行評估。 結(jié)果：細(xì)胞內(nèi)鐵染色：普魯士藍(lán)染色顯示USPIO標(biāo)記的INS-1細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小的藍(lán)色鐵顆粒。標(biāo)記效率的檢測：體外MRI掃描和普魯士藍(lán)染色提示,不同鐵濃度USPIO和FeraSpin S分別標(biāo)記2105INS-1細(xì)胞24h, MRI掃描T2信號隨標(biāo)記鐵濃度升高而降低,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的藍(lán)色鐵顆粒也相應(yīng)增加。在相同鐵濃度下作用24h, USPIO較FeraSpin S對INS-1細(xì)胞的標(biāo)記效率更高。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下USPIO標(biāo)記組、FeraSpin S標(biāo)記組和未標(biāo)記組INS-1細(xì)胞之間,細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。USPIO對細(xì)胞活力的影響：MTT結(jié)果顯示,USPIO和FeraSpinS在0-50μg Fe/mL濃度以下標(biāo)記INS-1細(xì)胞24h,細(xì)胞活力在超過30μg Fe/mL濃度后逐漸降低。USPIO對細(xì)胞增殖的影響：USPIO和FeraSpin S以0-50μg Fe/mL濃度標(biāo)記INS-1細(xì)胞24h,細(xì)胞生長能力在超過30μg Fe/mL濃度后逐漸降低。USPIO對細(xì)胞早期凋亡水平的影響：流式細(xì)胞儀檢測顯示,USPIO以0-50μg Fe/mL濃度標(biāo)記INS-1細(xì)胞24h,細(xì)胞凋亡／死亡在超過30μg Fe/mL濃度后逐漸增加。USPIO對細(xì)胞功能的影響：葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示,USPIO以0-50μg Fe/mL濃度標(biāo)記24h, Beta-TC-6細(xì)胞胰島素釋放功能在超過30μg Fe/mL濃度后明顯降低。 結(jié)論：制備的USPIO具有良好的生物相容性和超順磁性,能夠有效標(biāo)記INS-1以及Beta-TC-6細(xì)胞,對細(xì)胞的活性和功能在未超過30μg Fe/mL濃度的情況下沒有明顯影響,在標(biāo)記細(xì)胞的MRI體外掃描中表現(xiàn)出很強(qiáng)的磁信號。 第三部分Bcl-2功能化USPIO標(biāo)記小鼠原代胰島細(xì)胞MRI活體 示蹤研究 目的：在體外應(yīng)用USPIO對小鼠原代胰島細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,建立USPIO標(biāo)記小鼠胰島細(xì)胞同種異體腎包膜下移植模型,應(yīng)用3.0-T臨床磁共振成像系統(tǒng)動物線圈活體示蹤USPIO標(biāo)記小鼠胰島細(xì)胞。 方法：將制備的USPIO,分別取0,1.25,2.5,5,10,20,30,40,60,80μg Fe/mL不同濃度,進(jìn)行MRI體外掃描,觀察信號變化。分離純化150個C57BL/6小鼠胰島,用制備的PEG-USPIO標(biāo)記后,進(jìn)行C57BL/6小鼠同種異體腎包膜下移植,術(shù)后第1,8,15,21d對移植物進(jìn)行MRI活體示蹤。將移植模型腎臟進(jìn)行石蠟切片,胰島素免疫組織化學(xué)染色和普魯士藍(lán)染色觀察。 結(jié)果：通過USPIO以0,1.25,2.5,5,10,20,30,40,60,80μg Fe/mL濃度數(shù)量梯度的MRI體外掃描,確定MRI掃描的磁強(qiáng)回歸線性參數(shù)。USPIO10和30μgFe/mL濃度標(biāo)記的150個C57BL/6小鼠原代胰島同種異體腎包膜下移植,MRI活體示蹤可以觀測到理想的磁信號,時間可以持續(xù)21d,MRI信號強(qiáng)度隨移植后時間延長而逐漸減弱。移植模型腎石蠟切片行胰島素免疫組化/普魯士藍(lán)雙染色,證實(shí)腎包膜下USPIO標(biāo)記的胰島移植物存在及其被USPIO特異性標(biāo)記。 結(jié)論：制備的USPIO可以有效標(biāo)記小鼠胰島細(xì)胞系INS-1及Beta-TC-6和原代胰島,并通過3.0-T臨床磁共振成像系統(tǒng)動物線圈進(jìn)行同種異體腎包膜下移植MRI活體示蹤。 第四部分Exendin-4功能化USPIO靶向胰島細(xì)胞MRI活體示蹤研究 目的：嘗試Exendin-4-USPIO對胰島β細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記,體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其標(biāo)記有效性,體內(nèi)應(yīng)用3.0-T臨床磁共振成像系統(tǒng)動物線圈活體示蹤小鼠胰島素瘤。 方法：更換USPIO的靶向探針為exendin-4,常規(guī)體外驗(yàn)證其標(biāo)記胰島細(xì)胞有效性及細(xì)胞毒性。通過全身各器官病理切片及普魯士藍(lán)染色驗(yàn)證USPIO的體內(nèi)分布情況。通過exendin-4與量子點(diǎn)的連接,熒光成像驗(yàn)證exendin-4的靶向性。構(gòu)建INS-1種植瘤模型小鼠,通過尾靜脈注入exendin-4-USPIO24小時后,進(jìn)行MRI活體示蹤。將移植模型腎臟進(jìn)行石蠟切片,胰島素免疫組織化學(xué)染色和普魯士藍(lán)染色觀察驗(yàn)證USPIO標(biāo)記情況。 結(jié)果：新制備的exendin-4-USPIO具有良好的生物相容性,未見明顯細(xì)胞毒性。病理切片結(jié)果顯示,無exendin-4修飾的USPIO積聚于肝、腎、脾、肺等組織,但并不積聚于胰腺的內(nèi)、外分泌腺組織中；而exendin-4修飾的USPIO不僅在肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中非特異性聚集外,還在胰腺中存在,并在胰島中特異聚集。USPIO尾靜脈注入負(fù)瘤小鼠體內(nèi)24小時后,MRI活體示蹤可以觀測到胰島素瘤體部位明顯的磁信號。將瘤體行石蠟切片、胰島素免疫組化／普魯士藍(lán)雙染色,證實(shí)其被exendin-4-USPIO特異性標(biāo)記。 結(jié)論：制備的exendin-4-USPIO可以有效標(biāo)記小鼠胰島細(xì)胞系和原代胰島,并能夠?qū)π∈笠葝u素瘤進(jìn)行MRI活體特異性示蹤。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08;R735.9

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉再毅;王瑛;王廣誼;李曉紅;李晏;粱長虹;;超順磁性氧化鐵標(biāo)記脂肪干細(xì)胞移植入大鼠心臟后的活體磁共振示蹤成像[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2009年02期

2 倪萍;陳自謙;;胰島細(xì)胞移植磁共振掃描活體示蹤的序列優(yōu)化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年18期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 楊斌;功能化超小超順磁性納米鐵顆粒（USPIO）的合成及其在小鼠胰島細(xì)胞移植活體示蹤的應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2014年

2 楊俊杰;基因修飾在提高脂肪來源干細(xì)胞移植治療心梗療效和指導(dǎo)體內(nèi)示蹤中的應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 辛磊;低濃度SPIO標(biāo)記兔BMSCs的體外MR成像及RIRI兔體內(nèi)移植的活體示蹤研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2009年

2 林建浩;乳鼠雪旺氏細(xì)胞Sinerem體外標(biāo)記和磁共振成像的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

3 趙士宇;磁標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠肝切除術(shù)后肝再生作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

，

本文編號：1560413