本文關(guān)鍵詞： 細胞外基質(zhì)膠 Matrigel 人脂肪源性干細胞 創(chuàng)面愈合 細胞治療 組織工程　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:皮膚組織工程學(xué)的日益發(fā)展,為當下由燒傷、化學(xué)損傷等原因引起的皮膚損傷患者帶來了福音。在皮膚組織工程技術(shù)中,種子細胞和生物相容性支架是其關(guān)鍵所在。而其中,間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是種子細胞的研究熱點。從人類脂肪組織中分離得到的間充質(zhì)干細胞即稱為人脂肪干細胞(human adipose derived stem cells,hASCs),hASCs 具有易獲得、增殖速度快且可跨胚層多向分化等特點,是良好的組織工程種子細胞。研究表明,hASCs可有效的減輕炎癥反應(yīng),促進肉芽組織沉積、再上皮化、血管重建以及創(chuàng)面收縮,并且可以分化為表皮細胞、血管內(nèi)皮細胞,繼而達到使創(chuàng)面愈合的作用。研究表明,應(yīng)用單純干細胞進行移植治療后,干細胞的存活率較低且存活時間較短,這被認為是當下限制干細胞治療的主要因素。生物醫(yī)學(xué)組織工程的發(fā)展帶來的支架材料的改進為干細胞再生治療提供了新的策略。Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì),是EHS(Engelbreth-Holm-Swarm,EHS)小鼠肉瘤細胞分泌的一種凝膠狀蛋白質(zhì)混合物,主要成分包括:層黏連蛋白、膠原Ⅴ、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等,同時含轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子和其它在EHS肉瘤中自然表達的生長因子等,具有非常良好的可注射性以及組織相容性,由于Matrigel的構(gòu)成類似于許多組織中發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜細胞外環(huán)境,因而被細胞生物學(xué)家廣泛的用作培養(yǎng)細胞的底物,應(yīng)用于細胞生長、分化以及功能形態(tài)研究。因此,我們推測Matrigel可為干細胞提供不被體內(nèi)微環(huán)境損傷的三維支持,是一種理想的可注射生物支架材料。研究目的:本研究通過將hASCs接種于Matrigel中,再進一步將hASCs-Matrigel復(fù)合物采用局部注射方法移植至裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面,進而觀察其對創(chuàng)面修復(fù)的影響,并對其相關(guān)機理進行研究,最終實現(xiàn)為臨床上皮膚創(chuàng)面尤其是難治性皮膚創(chuàng)面的臨床治療提供新的思路及實驗依據(jù)。研究方法:第一部分:選擇臨床上人脂肪抽吸手術(shù)所得脂肪組織作為人脂肪干細胞的來源,以酶消化法從人脂肪組織中提取hASCs接種于培養(yǎng)皿,使用HG-DMEM培養(yǎng)基將其培養(yǎng)至第三代。利用倒置顯微鏡對原代細胞形態(tài)進行觀察;使用流式細胞儀鑒定細胞表型;加入不同的誘導(dǎo)劑驗證干細胞成骨分化及成脂分化的能力。第二部分:將人脂肪干細胞接種于Matrigel中,使用裸鼠建立背部全層皮膚缺損模型,并將實驗用裸鼠隨機分為3組:設(shè)立復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel),細胞治療組(hASCs)和對照組(PBS)。通過創(chuàng)面大體觀察來測定各組的愈合曲線進而對各組的愈合情況進行評估;通過活體成像觀察來確定hASCs移植后在裸鼠體內(nèi)的存活情況;各組分別在術(shù)后的1d、7d、14d獲取標本,進行標本HE染色,免疫組化染色等方法觀察和比較各組創(chuàng)面愈合水平;應(yīng)用qPCR檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(b-fibroblast growth factor,b-FGF)以及血小板衍生因子(platelet derived growth factor-bb,PDGF-bb)的基因表達,觀察hASCs注射至裸鼠皮膚創(chuàng)面的存活與轉(zhuǎn)歸。結(jié)果:第一部分:hASCs體外培養(yǎng)一周后,大多數(shù)細胞呈多邊形、梭形或不規(guī)則三角形,生長呈旋渦狀或束狀。細胞傳代后增殖速度較快,一周后可達90%融合度,且其免疫表型與臍帶血間充質(zhì)干細胞的表達具有高度一致性。繼續(xù)培養(yǎng)可見hASCs展現(xiàn)出了良好的成骨、成脂的多向分化能力。成骨誘導(dǎo)在20日可達到90%以上分化;成脂誘導(dǎo)在10日可達到90%以上分化。第二部分:1.創(chuàng)面愈合方面,通過大體皮膚愈合后創(chuàng)面面積繪制愈合曲線并對其進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)愈合時間最短(與其余兩組差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義),細胞治療組(hASCs)愈合時間次之(與對照組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義),而對照組(PBS)愈合時間最長。2.活體成像觀察結(jié)果顯示,復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)細胞熒光信號多于細胞治療組(hASCs),且復(fù)合治療組移植后的hASCs隨時間逐漸匯聚于皮膚創(chuàng)面,而細胞治療組移植后的hASCs相較于治療組則更加分散。3.病理學(xué)觀察HE染色結(jié)果顯示:各組術(shù)后第1d、7d以及14d取材行HE染色,可見術(shù)后第14d時復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合,表皮修復(fù)情況良好,呈復(fù)層上皮排列,同時可見部分炎性細胞浸潤。細胞治療組(hASCs)則仍有部分創(chuàng)面未能愈合,肉芽組織生長良好,已修復(fù)部分的表皮修復(fù)情況良好,表皮呈復(fù)層上皮排列,肉芽組織以及創(chuàng)面表面仍可見較多的炎性細胞浸潤。對照組(PBS組)則仍有相當一部分創(chuàng)面尚未能愈合,且已修復(fù)部分的表皮修復(fù)質(zhì)量明顯不及復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)與細胞治療組(hASCs),同時可見大量的炎性細胞浸潤,在尚未愈合的創(chuàng)口周圍可見有瘢痕組織增生。4.各組術(shù)后第1d、7d、14d取組織樣本行CD31染色觀察,可見術(shù)后14d復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合,表皮修復(fù)情況良好,呈復(fù)層上皮排列,創(chuàng)面淺面可見新生血管,深部血管則呈垂直創(chuàng)面的方向生長,且血管密度較大,可見部分炎性細胞浸潤。細胞治療組(hASCs組)則仍有部分創(chuàng)面未能愈合,肉芽組織生長良好,新生血管密度較為豐富,已修復(fù)部分的表皮修復(fù)情況良好,表皮呈復(fù)層上皮排列,肉芽組織以及創(chuàng)面表面仍可見較多的炎性細胞浸潤。對照組(PBS組)則有相當一部分創(chuàng)面尚未能愈合,炎性細胞浸潤較明顯,肉芽組織中新生血管數(shù)量較前兩組有明顯減少;qPCR結(jié)果顯示術(shù)后7d、14d復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)與細胞治療組(hASCs)的VEGF、EGF、bFGF、FDGF-bb基因表達均有所增高,而對照組則無明顯變化,其中復(fù)合治療組增高最為顯著,與細胞治療組(hASCs組)及對照組(PBS)均存在顯著性差異,而細胞治療組(hASCs)同時也與對照組(PBS)存在顯著性差異。研究結(jié)論:1.我們從臨床脂肪抽吸手術(shù)中獲取人脂肪組織抽吸物,并復(fù)制經(jīng)典的酶消化法從中分離出了 hASCs,通過細胞培養(yǎng)與傳代獲得第三代hASCs,并參照國際標準對其加以鑒定,從而獲得了本實驗所需的種子細胞。2.Matrigel復(fù)合hASCs可提高細胞在皮膚創(chuàng)面的存活率,并延長細胞的存活時間,從而增強人脂肪干細胞促進創(chuàng)面愈合的作用。3.人脂肪干細胞局部注射治療裸鼠全層皮膚缺損,可誘導(dǎo)創(chuàng)面局部的微血管再生,而Matrigel所提供的三維支持環(huán)境可以增強人脂肪干細胞的旁分泌作用,使促血管生成因子表達增強,使創(chuàng)面區(qū)域生成的微血管數(shù)量增多。4.人脂肪干細胞移植于裸鼠皮膚缺損區(qū)后可分化為表皮細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞等。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08;R64

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 朱桂英;柴家科;;脂肪間充質(zhì)干細胞促進皮膚創(chuàng)面修復(fù)及其作用機制探討[J];中國美容醫(yī)學(xué);2012年03期

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本文編號：1496459