本文關鍵詞：血管壁局部去交感神經對組織工程骨體內成骨效果的影響　出處：《第四軍醫(yī)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：在骨科臨床工作中,多種因素導致的大段骨缺損與骨不連仍舊是困擾骨科醫(yī)生的世界性難題。目前臨床上常用的治療方法有自體骨移植、異體骨移植、人工骨填充等。但由于供區(qū)受限、免疫原性、缺乏生物活性等原因限制了這些方法的臨床應用。組織工程骨的出現(xiàn)給這一問題的解決提供了一種可行的方法。而組織工程骨的血管化和神經化是組織工程骨實現(xiàn)臨床轉化的重要技術難題。因此研究組織工程骨血管化和神經化的機制,尋找血管化和神經化的最佳途徑是骨組織工程研究的當務之急。課題組以往研究發(fā)現(xiàn):血管束和感覺神經束植入組織工程骨后具有同等促成骨和神經化作用。然而實驗中所用的血管束本身含有大量交感神經分布于血管外膜支配中膜平滑肌。其促成骨和神經化作用是血管本身的作用還是外膜交感神經的作用?血管和神經在促進組織工程骨神經化和血管化過程中起著怎樣的協(xié)同作用?它們相互之間是怎樣的關系?這些仍是未知的科學問題。為此,本實驗首先嘗試使用顯微外科方法剝除家兔股動脈血管外膜,建立血管壁局部去交感神經的模型,然后將局部去交感神經血管和正常血管束分別植入組織工程骨,對比觀察其對組織工程骨成骨影響,闡明血管和神經在組織工程骨修復大段骨缺損過程中的作用。第一部分顯微外科技術構建家兔股動脈局部去交感神經模型目的研究顯微外科技術在體內去除兔股動脈交感神經的可行性,排除血管外膜交感神經的影響,為進一步研究組織工程骨神經化機制提供可靠的動物實驗模型。方法21只新西蘭大白兔隨機分4組:對照組(n=3)、4周組(n=6)、8周組(n=6)、12周組(n=6)。分離21只新西蘭大白兔雙側股動脈,實驗組在手術顯微鏡放大10倍視野下于股動脈中段剝除血管外膜;對照組僅做血管顯露。于術后4周、8周、12周分別取材行蘇木精·伊紅(he)染色觀察血管壁結構、乙醛酸熒光染色觀察交感神經分布及其熒光強度、westernblot檢測交感神經特異性蛋白酪氨酸羥化酶(th)的含量。結果he染色的結果:3個實驗組動脈外膜層缺失或明顯變薄,平滑肌層和內膜無明顯增厚或者變薄,對照組動脈血管各層結構完整。乙醛酸染色結果:對照組、4周組、8周組、12周組的熒光強度a值分別為:0.08124±0.00260、0.02920±0.00206、0.02661±0.00233、0.03094±0.00211,n=6各實驗組與對照組相比熒光分布范圍明顯縮小,熒光強度顯著減弱,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),各實驗組之間的熒光強度差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)westernblot結果:對照組、4周組、8周組、12周組wb條帶半定量分析值分別為:0.8626±0.03519、0.3631±0.03019、0.3964±0.02239、0.3487±0.02356,n=6各實驗組與對照組相比,th的含量均明顯減少,結果具有統(tǒng)計學意義(p0.05);而3個實驗組間差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論顯微外科手術剝除法可有效去除動脈血管外膜的交感神經。該方法作用持久,交感神經去除徹底且在4周、8周、12周3個觀察點內無論從神經遞質方面還是特異性蛋白方面都沒有觀察到交感神經的明顯再生,故該方法可為研究單純血管因素對組織工程骨的影響提供持久、有效、可靠的動物模型。目的將種子細胞bmsc與β—tcp多孔生物陶瓷支架材料復合培養(yǎng),使種子細胞bmsc能夠在支架材料上成活和生長,確保體內實驗的順利進行。方法取胎兔原代bmsc,培養(yǎng)至p3代,以107/ml的密度接種于β—tcp多孔生物陶瓷支架材料上,材料為長方體,高15mm,底面為4mmx4mm的正方形。以負壓吸引法排除材料內的氣體,使細胞懸液充分進入材料,隨后放入培養(yǎng)皿中復合培樣。復合培養(yǎng)5天后用戊二醛固定樣本,于掃描電鏡下觀察bmsc的貼附和生長狀態(tài)。結果36小時后觀察可見bmsc貼壁生長,呈長梭形,但仍有大量未貼壁的雜質細胞。傳代后胎兔bmsc生長狀態(tài)良好,貼壁生長呈長梭形或漩渦狀,雜質細胞逐漸減少。bmsc與β—tcp多孔生物陶瓷支架材料復合培養(yǎng)5天后,掃描電鏡下觀察種子細胞bmsc在材料上貼附和生長狀況。電鏡下可見β—tcp表面bmsc細胞附著,細胞排列緊密并且生長狀態(tài)良好。結論bmsc可以貼附在β—tcp多孔生物陶瓷支架材料上,并且生長狀態(tài)良好,因此可用于下一步體內植入實驗。第三部分血管壁局部去交感神經對組織工程骨體內成骨效果的影響目的研究血管壁局部去交感神經對組織工程骨體內成骨效果的影響,進一步探究組織工程骨血管化、神經化與三者之間的關系。方法10只新西蘭大白兔隨機分為3組。于10只新西蘭大白兔右橈骨構建1.5cm臨界骨缺損。實驗組8只:正常血管束植入組4只(組織工程骨+正常血管束),去血管外膜組(組織工程骨+局部去外膜血管束),對照組2只(僅植入組織工程骨),組間做好標記。術后12周取材,行大體觀察、x線片、顯微ct、四環(huán)素鈣黃綠素熒光雙標、vg染色等處理。檢測組織工程骨體內成骨的效果。結果大體觀察:血管移植組和去血管外膜組骨缺損斷端已經愈合,組織工程骨支架材料在缺損部位的表面不可見;而對照組中組織工程骨支架材料仍舊清晰可見,骨缺損的斷端愈合情況較差。x線片:與對照組相比血管移植組和去血管外膜組x線片中的材料影已經變得模糊不清甚至可以觀察到骨髓腔的再通,但血管移植組和去血管外膜組之間并沒有觀察到肉眼可見的差異;對照組β-tcp材料陰影仍舊明顯,可輕易辨認出材料的輪廓。顯微ct:1.標本三維重建:血管移植組和去血管外膜組紅色的成骨區(qū)域要遠大于對照組的紅色成骨區(qū)域;而血管移植組和去血管外膜組藍色材料殘留的區(qū)域要明顯小于對照組材料的殘余量。去血管外膜組和正常血管組無肉眼可見的差別。2.三組材料的新生骨體積分數(shù)BVF:血管移植組和去血管外膜組與對照組相比成骨量明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),但是血管移植組和去血管外膜組成骨量之間的差異沒有統(tǒng)計學差異(p0.05)。3.三組材料剩余體積比例:血管移植組和去血管外膜組與對照組相比材料殘余量明顯減少差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),但是血管移植組和去血管外膜組材料的殘余量之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。四環(huán)素和鈣黃綠素熒光雙標實驗:礦物沉積率MAR:血管移植組和去血管外膜組比對照組礦物沉積率MAR明顯增高差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),但血管移植組和去血管外膜組材料的礦物沉積率MAR之間沒有統(tǒng)計學差異。VG染色:與對照組相比血管移植組和去血管外膜組紅色成骨區(qū)域的面積要明顯大于對照組的成骨區(qū)域面積。且血管外膜移植組和去血管外膜組沒有肉眼可見的明顯差異。結論去交感神經血管束和正常血管束植入組織工程骨內12周與單純組織工程骨相比均具有顯著促進組織工程骨體內成骨的作用,且兩者促成骨作用無統(tǒng)計學差異。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R68

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