本文關(guān)鍵詞：茵陳蒿湯對(duì)膽汁性肝纖維化大鼠模型肝卵圓細(xì)胞的影響

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【摘要】：一、背景和目的 肝纖維化是由多種致病因子所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,是一動(dòng)態(tài)發(fā)展過程,是各種肝臟疾病最終發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)病理階段,具有可逆性。在肝膽外科臨床中,膽管梗阻、膽汁淤積是比較常見的病理環(huán)境,較長(zhǎng)時(shí)間的梗阻,可誘發(fā)永久性肝損害,甚至發(fā)展成肝纖維化及膽汁性肝硬化,嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量及生存率。近年來(lái)雖然對(duì)膽汁淤積性肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),但仍是臨床治療的難題。部分患者即使接受了成功的膽汁引流手術(shù),黃疸消退緩慢,肝功能恢復(fù)不良,術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高,使得患者平均住院天數(shù)延長(zhǎng),治療費(fèi)用增加,心理負(fù)擔(dān)加重,因此,早期預(yù)防和阻斷肝進(jìn)行性纖維化是治療的關(guān)鍵所在。 既往研究發(fā)現(xiàn)各種慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展與類似于卵圓細(xì)胞的肝前體細(xì)胞的活化有密切的關(guān)系。這種肝前體細(xì)胞主要定位于匯管區(qū)、纖維間隔、匯管區(qū)旁肝實(shí)質(zhì)、假小葉及炎癥邊界,具有增殖分化為成熟肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙潛能。隨著大鼠肝卵圓細(xì)胞特異性標(biāo)記物0V-6的發(fā)現(xiàn),卵圓細(xì)胞相關(guān)研究成為了熱點(diǎn)。特別是肝卵圓細(xì)胞參與肝臟的損傷修復(fù)、肝臟纖維化的相關(guān)研究。這些理論為研究肝臟損傷的保護(hù)、治療及肝纖維化的形成機(jī)制提供了最新途徑。 膽汁淤積性肝纖維化屬于中醫(yī)“黃疸”的范疇。茵陳蒿湯出自東漢·張仲景《傷寒論》,由茵陳、梔子和大黃組成,具有清熱利濕退黃之功效,是治療濕熱黃疸的主方�，F(xiàn)代研究表明,茵陳蒿湯具有利膽、保肝、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等作用。近年來(lái)對(duì)茵陳蒿湯抗肝纖維化機(jī)制的相關(guān)研究屢見不鮮。 因此,本研究的主要目的是通過結(jié)扎Wistar大鼠膽總管,模擬膽管梗阻膽汁淤積肝纖維化病理狀態(tài),采用免疫組化、PCR技術(shù),觀察茵陳蒿湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化肝卵圓細(xì)胞增殖的影響和肝星狀細(xì)胞激活的調(diào)節(jié),探討茵陳蒿湯在保肝和抗肝纖維化中的作用,為臨床治療膽汁淤積性肝纖維化提供一定的理論依據(jù)。 二、材料與方法 雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分成四組,即假手術(shù)對(duì)照組(10只)、膽總管結(jié)扎組(10只)、再通組(10只)和再通+中藥干預(yù)組(10只)。假手術(shù)對(duì)照組僅作膽總管分離,不作膽總管結(jié)扎,其余各組采用膽總管結(jié)扎制備膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型,膽總管結(jié)扎術(shù)后第7天、第10天分別行膽道再通,再通術(shù)后第1天同時(shí)分別給予中藥灌胃和等量生理鹽水灌胃3天。各組大鼠術(shù)后相同條件下飼養(yǎng)。假手術(shù)對(duì)照組和膽總管結(jié)扎組分別于術(shù)后第7天、第10天兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)處死大鼠,再通組和再通+中藥干預(yù)組分別于再通術(shù)后第3天處死大鼠,每組各處死5只。肝臟標(biāo)本：取肝右葉應(yīng)用10%福爾馬林固定留作免疫組化；取肝左葉-80℃凍存留作RT-PCR檢測(cè)。 1、通過肉眼及HE染色分別觀察膽管梗阻不同時(shí)相點(diǎn)肝組織形態(tài)學(xué)改變。 2、通過免疫組化,OV-6標(biāo)記肝卵圓細(xì)胞,動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)相點(diǎn)肝卵圓細(xì)胞的數(shù)目及分布范圍。 3、通過RT-PCR檢測(cè)各目的基因mRNA的表達(dá)：α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及I型膠原蛋白(COL Ⅰ),動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)相點(diǎn)各基因的表達(dá)情況。 三、結(jié)果 1、大體結(jié)果 (1)假手術(shù)對(duì)照組：肝臟標(biāo)本各肝葉色澤紅潤(rùn),表面光滑。 (2)膽總管結(jié)扎組：Wistar大鼠膽管結(jié)扎后可見肝臟逐漸黃染并腫脹,部分質(zhì)地變硬,肝臟淤血、水腫,10%福爾馬林固定大鼠肝葉標(biāo)本后,可見表面粗糙,顏色灰白等肝組織早期纖維化的表現(xiàn),并隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。 (3)再通組：肝臟淤膽腫脹程度較再通組有所減輕。 (4)再通+中藥干預(yù)組：肝臟病變與再通組相比肉眼無(wú)明顯改善。 2、HE染色結(jié)果 (1)假手術(shù)對(duì)照組：未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、亦未見肝細(xì)胞變性、壞死等。 (2)膽總管結(jié)扎組：膽管結(jié)扎術(shù)后第7天肝小葉結(jié)構(gòu)完整,可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞腫脹,少數(shù)出現(xiàn)變性壞死,重者見片狀出血和壞死,肝組織匯管區(qū)可見膽管增生和纖維細(xì)胞增生性改變；術(shù)后第10天肝小葉結(jié)構(gòu)受到破壞,可見肝細(xì)胞空泡變性及壞死,纖維化程度逐漸加重。 (3)再通組：膽道再通術(shù)后肝細(xì)胞變性、壞死、腫脹程度減輕,肝組織仍可見炎性改變及部分纖維化。 (4)再通+中藥干預(yù)組：與再通組相比,該組大鼠肝臟病變情況有所減輕。 3、免疫組化結(jié)果 OV-6陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)部位主要分布于匯管區(qū)膽管、纖維間隔、肝間質(zhì)新增生膽管及無(wú)管腔的小膽管細(xì)胞胞漿中。OV-6免疫組化陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)目及分布范圍隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。應(yīng)用IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖象分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞著色面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,假手術(shù)對(duì)照組在各時(shí)相點(diǎn)有極少量陽(yáng)性表達(dá),膽總管結(jié)扎組OV-6陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積在造模后第7天、第10天均較假手術(shù)對(duì)照組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與膽總管結(jié)扎組比較,造模7天后再通組OV-6陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積有所增加,造模10天后再通組OV-6陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積亦有所增加,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。再通+中藥干預(yù)組OV-6陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)均較再通組增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4、RT-PCR結(jié)果 應(yīng)用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如下：第7天膽總管結(jié)扎組α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量與假手術(shù)對(duì)照組相比升高了6.72倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),再通組α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量比假手術(shù)對(duì)照組升高了2.59倍,而再通+中藥干預(yù)組α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量只比假手術(shù)對(duì)照組升高了1.38倍,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)：與假手術(shù)對(duì)照組相比,第10天膽總管結(jié)扎組α-SMA mRNA (?)的相對(duì)表達(dá)量顯著增高到13.38倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而再通組α-SMA mRNA表達(dá)升高了5.94倍,再通+中藥干預(yù)組α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量只升高了1.56倍,差異不顯著(P0.05),再通+中藥干預(yù)組第7天與再通組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),再通+中藥干預(yù)組第10天與再通組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而再通+中藥干預(yù)組與膽總管結(jié)扎組各時(shí)相點(diǎn)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。膽總管結(jié)扎組COL1mRNA表達(dá)在第7天較假手術(shù)對(duì)照組升高了9.94倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),第10天時(shí)進(jìn)一步升高至10.71倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);再通組COL1mRNA表達(dá)在第7天較對(duì)假手術(shù)對(duì)照組升高了3.95倍,第10天升高至5.41倍,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);再通+中藥干預(yù)組在第7天和第10天與假手術(shù)對(duì)照組相比改變不明顯,再通+中藥干預(yù)組第7天與再通組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),再通+中藥干預(yù)組第10天與再通組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而再通+中藥干預(yù)組與膽總管結(jié)扎組各時(shí)相點(diǎn)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？梢�,α-SMA和COL1基因相對(duì)表達(dá)量隨著膽管結(jié)扎天數(shù)的增加而逐漸升高；再通術(shù)后早期再通較晚期再通α-SMA和COL1基因相對(duì)表達(dá)量減少；α-SMA和COL1基因表達(dá)變化趨勢(shì)在各組中具有一致性；茵陳蒿湯可以使膽汁性肝纖維化大鼠模型α-SMA mRNA和COL1mRNA表達(dá)呈明顯下降的趨勢(shì)。 四、結(jié)論 1、本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎肝外膽管造成膽管梗阻,成功復(fù)制了膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型,觀察了不同時(shí)相點(diǎn)肝臟的病理學(xué)改變,證實(shí)隨著膽管梗阻時(shí)間的延長(zhǎng),其肝臟膽汁淤積性、纖維化程度呈進(jìn)行性加重趨勢(shì),茵陳蒿湯在減輕肝纖維化大鼠的肝臟病理?yè)p傷方面優(yōu)于單純?cè)偻?可以促進(jìn)再通術(shù)后肝臟的病理和功能改善。 2、本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可以通過上調(diào)膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型肝組織中OV-6的表達(dá),促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞的增殖,改善肝纖維化的進(jìn)程。 3、本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可以抑制肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA和COL1基因的表達(dá),可能在一定程度上減緩肝纖維化的程度。 4、本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的形成是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程,茵陳蒿湯具有上調(diào)肝卵圓細(xì)胞OV-6的表達(dá),促使膠原蛋白沉積降解以及肝星狀細(xì)胞凋亡的作用,這可能是茵陳蒿湯減緩肝纖維化進(jìn)程的機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：茵陳蒿湯 膽管結(jié)扎肝纖維化 卵圓細(xì)胞 肝星狀細(xì)胞 α-平滑肌動(dòng)蛋白 Ⅰ型膠原蛋白
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R285.5;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 目錄13-14
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明14-15
• 前言15-17
• 研究現(xiàn)狀、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 1.1 對(duì)象和方法17-23
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 1.1.2 主要設(shè)備材料、試劑及中藥17-18
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作18
• 1.1.4 標(biāo)本采集及保存18
• 1.1.5 觀察指標(biāo)和方法18-23
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 1.2 結(jié)果23-34
• 1.2.1 大體形態(tài)學(xué)結(jié)果23
• 1.2.2 HE染色結(jié)果23-25
• 1.2.3 免疫組化結(jié)果25-27
• 1.2.4 RT-PCR結(jié)果27-34
• 1.3 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明42-43
• 附圖43-45
• 綜述45-55
• 綜述參考文獻(xiàn)51-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：998403