本文關鍵詞：藍氏賈第鞭毛蟲三種基因功能研究載體的構建

  更多相關文章： 藍氏賈第鞭毛蟲 標記載體 表達載體 蛋白標簽

【摘要】：藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡稱賈第蟲)是一種單細胞寄生性原蟲，可引起藍氏賈第鞭毛蟲病。賈第蟲是生物進化過程中最早分化出來的真核生物之一，在生物進化中有著特殊的地位。隨著賈第蟲基因組測序的完成，賈第蟲研究逐漸步入基因功能階段。外源基因及重組基因的體內表達是研究基因功能的重要手段。目前分子生物學研究中常見的表達載體基本不能用于賈第蟲基因功能研究�；谝陨蟽蓚�方面的要求，本研究擬構建一個帶有HA標簽的賈第蟲基因快速標記載體和一個賈第蟲穩(wěn)定表達載體，并進一步構建帶有SNAP/CLIP融合蛋白標簽的表達載體。 本研究采用重疊PCR的方法將Neo基因置于gdh啟動子調控下構建抗性基因表達框，并插入pGEM-5zf(+)載體，獲得帶有Neo篩選標記的重組載體pGLgdh-Neo；將基因合成所得3'末端帶有3個HA標簽的MCS區(qū)克隆至上述載體，構建了帶有MCS區(qū)及3個HA標簽的可快速標記藍氏賈第鞭毛蟲基因的重組載體pGLMCS-3HA-gdh-Neo，長度為4268bp。以賈第蟲組蛋白H2A為標記基因驗證所構建載體的有效性。對H2A賈第蟲重組株進行基因組PCR、蛋白質印跡及免疫熒光分析。H2A重組質粒穩(wěn)定轉染至賈第蟲滋養(yǎng)體并正確整合至其基因組，可表達HA標記的H2A。 以pGLgdh-Neo為基礎，在gdh5'UTR端插入賈第蟲tim基因以方便載體與基因組整合，得到pGLtim-gdh-Neo；設計并合成α2-Tubulin啟動子驅動的含有16個酶切位點的MCS區(qū)的完整表達框，ApaⅠ單酶切插入pGLtim-gdh-Neo，構建了可穩(wěn)定轉染，，帶有多克隆位點區(qū)及Neo抗性基因的重組表達載體pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo，其長度為5395bp。在MCS區(qū)插入Luc，對Luc重組株進行熒光素酶活性檢測以驗證重組載體有效性。Luc重組質粒pGLtim-Tub-Luc-gdh-Neo穩(wěn)定轉染至賈第蟲，且Luc重組株熒光素酶在蟲體中獲得表達。 分別將SNAP/CLIP序列克隆至重組載體pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo的MCS區(qū)，構建分別含有SNAP/CLIP融合蛋白標簽的表達載體。 本研究成功構建了賈第蟲快速標記載體pGLMCS-3HA-gdh-Neo，穩(wěn)定表達載體pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo及帶有SNAP/CLIP融合蛋白標簽的表達載體，可用于賈第蟲基因的原位標記、蛋白的亞細胞定位、基因過表達或敲除、蛋白相互作用及活細胞中融合蛋白標記等方面的研究，為賈第蟲基因功能的研究提供有力平臺。
【關鍵詞】：藍氏賈第鞭毛蟲 標記載體 表達載體 蛋白標簽
【學位授予單位】：大連大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R382.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 1 實驗一藍氏賈第鞭毛蟲基因快速標記載體的構建14-33
• 1.1 實驗材料與試劑14-16
• 1.1.1 蟲株與質粒14-15
• 1.1.2 試劑15
• 1.1.3 培養(yǎng)基15-16
• 1.2 實驗儀器16
• 1.3 實驗方法16-26
• 1.3.1 藍氏賈第鞭毛蟲基因組 DNA 的提取16-17
• 1.3.2 pGL gdh-Neo重組質粒構建17-22
• 1.3.3 賈第蟲快速標記載體pGL MCS - 3HA -gah- Neo 的構建22-23
• 1.3.4 應用重組載體pGL MCS - 3HA -gdh- Neo 標記賈第蟲 H2A 基因23-24
• 1.3.5 H 2A 重組質粒電穿孔轉染及 G418 篩選24-25
• 1.3.6 H2A 賈第蟲重組株基因組 PCR 鑒定25
• 1.3.7 H2A 賈第蟲重組株蛋白質印跡分析25
• 1.3.8 H2A 賈第蟲重組株免疫熒光分析25-26
• 1.4 實驗結果與分析26-32
• 1.4.1 藍氏賈第鞭毛蟲基因組總 DNA 的提取26-27
• 1.4.2 gdh 基因側翼序列和 Neo 基因編碼序列的 PC R 擴增27-28
• 1.4.3 片段 gdh 5' UT R- N eo -gdh 3 ' U T R 的擴增28
• 1.4.4 pGL gdh- Neo 重組質粒 PCR 鑒定28-29
• 1.4.5 GlH2A 基因的擴增29
• 1.4.6 GlH2A 的標記載體pGL H2A -3HA- gdh -Neo 構建29-30
• 1.4.7 H2A 賈第蟲重組株基因組 PC R 分析30
• 1.4.8 H2A 賈第蟲重組株蛋白質印跡分析30-31
• 1.4.9 H2A 賈第蟲重組株免疫熒光分析31-32
• 1.5 實驗討論32-33
• 2 實驗二藍氏賈第鞭毛蟲穩(wěn)定表達載體的構建33-44
• 2.1 實驗材料和質粒33-34
• 2.1.1 質粒33-34
• 2.1.2 實驗試劑34
• 2.2 實驗儀器及設備34
• 2.3 實驗方法34-39
• 2.3.1 pGL tim-gdh-Neo 重組質粒構建34-36
• 2.3.2 pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo 重組質粒構建36-37
• 2.3.3 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重組質粒構建37-38
• 2.3.4 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重組質粒電穿孔轉染及 G418 篩選38-39
• 2.3.5 熒光素酶活性檢測39
• 2.4 實驗結果與分析39-42
• 2.4.1 tim 基因的 PCR 擴增39-40
• 2.4.2 pGL tim-gdh-Neo 重組質粒構建40
• 2.4.3 pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo 重組質粒構建40-41
• 2.4.4 Luc 的 PCR 擴增41
• 2.4.5 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重組質粒構建41-42
• 2.4.6 熒光素酶活性檢測42
• 2.5 實驗討論42-44
• 3 實驗三 藍氏賈第鞭毛蟲帶有 SN A P/ CLIP 融合蛋白標簽的表達載體構建44-50
• 3.1 實驗材料和質粒44-45
• 3.1.1 質粒44-45
• 3.1.2 實驗試劑45
• 3.2 實驗儀器及設備45
• 3.3 實驗方法45-47
• 3.3.1 SNAP/CLIP 的 PC R 擴增45-46
• 3.3.2 SNAP/CLIP 標簽重組質粒構建46-47
• 3.3.3 菌種凍存47
• 3.4 實驗結果與分析47-49
• 3.4.1 SNAP/CLIP 的 PCR 擴增47
• 3.4.2 PCR法鑒定pGL tim-Tub- SNAP/CLIP- gdh- Neo 重組質粒47-48
• 3.4.3 雙酶切法鑒定pGLtim -Tub- SNAP/ CLIP- gdh - Neo 重組質粒48-49
• 3.5 實驗討論49-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-52
• 論文綜述52-59
• 參考文獻57-59
• 附錄A 縮寫詞59-60
• 附錄B 主要溶液的配制60-65
• 附錄C 相關載體說明65-80
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況80-81
• 致謝81

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳麗鳳;李建華;劉全;趙月平;曹利利;張西臣;;犬賈第蟲病毒轉染載體介導的綠色熒光蛋白在犬賈第蟲體內的表達[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2007年01期

2 巨紅妹;王乙惠;張霞;王云華;李雅杰;;藍氏賈第鞭毛蟲基因快速標記載體的構建[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2012年03期

本文編號：985766